1. Introducción

En los últimos años, ha aumentado el interés en los bacteriófagos o fagos, puesto que las nuevas variables a tener en cuenta son: La resistencia bacteriana a los antimicrobianos encontrada tanto en animales como en humanos (^{Ngamwongsatit et al., 2016}; ^{Zwe et al., 2018}; ^{Parry-Hanson et al., 2020}; ^{Assafi et al., 2020}), la transferencia de dichos genes de resistencia en el medio ambiente a través de las aguas residuales de los centros de producción (^{Hubbard et al., 2020}; ^{Mazhar et al., 2020}; ^{Amato et al., 2020}) y la prohibición del uso de antibióticos como promotores de crecimiento en algunos países (^{ESVAC, 2017}).

En la última década, se han publicado varios artículos de investigación experimental sobre el empleo de fagos como sustitutos de antibióticos en la industria avícola (Fig. 1a). Sin embargo, dichos trabajos están dirigidos a su aplicación terapéutica mas no a su utilización como promotor de crecimiento; del mismo modo, pocos trabajos utilizaron la dosificación en masa mediante el alimento o el agua, en su lugar, se enfocan en la dosificación individualizada mediante sondas y otras herramientas (Fig. 1b).

El presente trabajo revisa el uso de cocteles de bacteriófagos líticos como promotores de crecimiento y sus efectos sobre los parámetros productivos, estrategias de protección contra los cambios de pH y las altas temperaturas, las vías de administración para su aplicación en masa en crianza comercial y su comparación con los promotores de crecimiento de tipo antibiótico.

2. ¿Qué son los bacteriófagos?

Los bacteriófagos o fagos son los depredadores naturales de las bacterias, estos virus actúan como parásitos intracelulares de las mismas y tienen alta especificidad, por lo cual no afectan a los microorganismos benéficos (^{Gebru et al., 2010}). Además, estos virus se encuentran en grandes cantidades en la naturaleza (^{Welsh et al., 2020}).

Los fagos tienen distintos ciclos de infección dentro del hospedero bacteriano: infección lítica, lisogénica, pseudo-lisogénica y crónica (^{Weinbauer, 2004}). Según el ciclo de infección se pueden clasificar en fagos virulentos o líticos y fagos lisogénicos o templados. Los fagos líticos no permiten la multiplicación bacteriana, no obstante, los templados sí la permiten cuando la población de estas es baja. De hecho, los fagos templados juegan un papel importante al transmitir genes de resistencia antimicrobiana (^{Colomer-Lluch, 2011}; ^{Wipf et al., 2014}). Los estudios actuales de la fago-terapia se orientan al uso de fagos líticos, pertenecientes a los Caudovirales que comprenden a las familias Myoviridae, Siphoviridae y Podoviridae (^{Ackerman, 2011}).

La infección de los fagos líticos inicia con el reconocimiento de receptores específicos en la membrana bacteriana y la consecuente adsorción del virus, luego, el fago introduce su material genético (ADN o ARN) en la bacteria y posteriormente se replica dentro de ella. Finalmente, liberan holinas y endolisinas para formar poros en la membrana, causando despolarización que produce lisis bacteriana y con ello liberación de nuevos fagos (Figura 2). Por lo tanto, se justifica el uso exclusivo de fagos líticos en avicultura comercial.

3. Bacteriófagos usados contra bacterias que atacan a las aves

Los fagos fueron obtenidos tanto de aguas residuales, heces y tejidos, los cuales fueron desafiados con algunas de las principales bacterias patógenas que aquejan a la avicultura como las causantes de colibacilosis, tifosis y pullorosis aviar demostrando ser eficaces en reducir la mortalidad de las aves y la población de las bacterias patógenas; la mayor dosis empleada fue de 2,5x10⁹ UFP/animal y se suministraron en medio sólido y líquido (Tabla 1).

Figura 1 a Investigaciones experimentales de bacteriófagos usados como terapéuticos y promotores de crecimiento en avicultura mediante el alimento o agua según especie avícola. b Investigaciones experimentales de bacteriófagos usados como terapéuticos y promotores de crecimiento en avicultura suministrados mediante el agua y el alimento. Información obtenida de la base de datos de Scopus (Criterio de búsqueda: Título de artículo, resumen y palabras clave: “poultry”, “phages” en el periodo 2010-2021). 

Figura 2 a Estructura de bacterias y fagos, y símbolos que representan proteínas codificadas por fagos. b el ciclo de infección de los fagos. Adaptado de ^{Santos et al. (2018}). 

La vía oral es la más práctica en crianza comercial, ya que permite realizar tratamientos en grandes cantidades de aves con menos tiempo y recursos, mediante el agua o alimento. Se ha demostrado que los fagos agregados tanto en el agua como en el alimento llegan a los distintos órganos internos afectados por las bacterias objetivo (^{Hong et al., 2013}; ^{Seo et al., 2018}). Además, según los estudios realizados, los efectos de la fago-terapia depende de la concentración y cantidad de dosis y la duración del tratamiento. Por lo tal motivo, se justifica la utilización de los fagos líticos en crianza comercial ya que reducen de mortalidad incluso en aves desafiadas con dosis letales de bacterias patógenas.

4. Fagos protegidos

El pH 7 es el óptimo para estos virus, con una reducción de títulos de fagos a medida que disminuye el pH, no resisten a medios muy ácidos (pH<3). Teniendo en cuenta que el pH gástrico de los pollos es aproximadamente 2,8 (^{Colom et al., 2015}), es natural que muchos se pierdan en ese tramo del tracto digestivo y es necesario protegerlos (Colom et al., 2015; ^{Kaikabo et al., 2016}; ^{Tie et al., 2018}).

Tabla 1 Efecto de la inclusión de fagos en aves desafiadas con bacterias patógenas 

¹Suspensión en buffer SM.

Tabla 2 Efecto de fagos protegidos sobre la población de bacterias patógenas como desafío (UFC/g) 

C: control, NP: no protegido, P: protegido, DPI: días post infección. ^a-c Valores representan el promedio ± SEM. Valores en una fila con diferente letra tienen diferencia significativa.

Además, se observó disminución de títulos de fagos a temperatura de 70°C durante 40 minutos o más y que no resisten temperaturas mayores o iguales a 80°C (^{Tie et al., 2018}), por lo que el proceso de peletizado puede disminuir los títulos de fagos y es necesario protegerlos. Por tal motivo, se probó la encapsulación para proteger los fagos evidenciando menor mortalidad de las aves con fagos protegidos comparados con los no protegidos 16,7% y 50,0% respectivamente (^{Kaikabo et al., 2016}), mayor cantidad de fagos en el ciego de las aves a las 48 y 72 horas post tratamiento en fagos protegidos que en no protegidos existiendo diferencia estadística (^{Colom et al., 2015}). Además, se observaron mejores resultados en la reducción de bacterias patógenas en fagos protegidos, esto debido a una menor pérdida de títulos de fagos al transitar por el sistema gastrointestinal que tiene cambios de pH y temperatura (Tabla 2), aunque dichos estudios se evaluaron a nivel de género bacteriano. Por lo tanto, la protección es una estrategia para disminuir la pérdida de títulos de fagos de los cocteles mixtos de fagos líticos y obtener mejores resultados.

5. Fago-resistencia

Dado que las bacterias y bacteriófagos co-evolucionaron desde la existencia de ambos, es lógico pensar que las presas (bacterias) han desarrollado estrategias para eludir a sus depredadores (fagos) y estos han desarrollado formas de superar dichas estrategias (Tabla 3). De hecho, existen reportes sobre la fago-resistencia bacteriana (^{Carvalho et al., 2010}; ^{Fischer et al., 2013}; ^{Colom et al., 2015}; ^{Sørensen et al., 2015}; ^{Richards et al., 2019}) y se han estudiado los diversos mecanismos como: pérdida de fago-receptores, modificación de fago-receptores, sistema CRISPR-Cas y producción de matriz de polisacáridos (^{Brockhurst et al., 2017}).

La modificación y pérdida de fago receptores sirven para evitar la adhesión del fago a la superficie bacteria, pero esto reduce la multiplicación bacteriana y los fagos pue den cambiar sus fibras de cola para encontrar los recep tores recién alterados (^{Munsch-Alatossava & Alatossava, 2013}). En cuanto a la producción de polisacáridos, estos evitan la adhesión de los fagos, sin embargo, los fagos pueden producir despolimerasas para degradarlos (^{Wang et al., 2019}). Finalmente, el sistema CRISPR-Cas forma parte del sistema inmune adaptativo de las bacterias y lo utilizan para degradar el material genético del fago, no obstante, algunos fagos pueden proteger su material ge nético con una cubierta proteica (^{Malone et al., 2020}). Por otro lado, para combatir la fago-resistencia contamos con cocteles de fagos y quorum quenching (^{Hoque et al., 2016}; ^{Quiroz-Guzmán et al., 2018}; ^{Mion et al., 2019a}; ^{Mion et al., 2019b}; ^{Richards et al., 2019}); por lo tanto, se justifica que el empleo de fagos en avicultura comercial debe ser en cocteles o en combinación con quorum quenching.

6. Empleo de cóctel de fagos en aves

La mejor manera para emplear fagos en producción avícola comercial es mediante cocteles (^{Zhao et al., 2012}; ^{Wang et al., 2013}; ^{Kim et al., 2013}; ^{Kim et al., 2014}; ^{Ahmadi et al., 2016}; ^{Kim et al., 2017}; ^{Clavijo et al., 2019}), ya que es difícil determinar todas las cepas bacterianas presentes en un centro de producción avícola y la presencia de bacte rias fago-resistentes. Se han estudiado tanto fagos indivi duales como cocteles simples y mixtos. Donde, la diferen cia entre fagos individuales y cocteles es la cantidad de fagos contra un mismo género bacteriano, donde a partir de dos fagos se considera como coctel, sin importar a que familia de fago pertenecen (^{Fischer et al., 2013}). La dife rencia entre cocteles simples y cocteles mixtos radica en la variedad de fagos contra géneros bacterianos, donde se considera como coctel mixto a partir de dos géneros bacterianos (^{Kim et al., 2014}; ^{Schulz et al., 2018}). Si bien es cierto que los fagos tienen un espectro limitado, los cocteles mixtos son una estrategia para ampliar dicho espectro.

Los estudios realizados iniciaron con dosis bajas y fueron aumentando gradualmente, incluso, incrementaron los géneros y cepas bacterianas objetivo, formando cocteles y demostrando resultados superiores a los fagos individuales. Además, los estudios parecen indicar que los cocteles mixtos son más eficientes que los cocteles simples al controlar la población de bacterias potencialmente patógenas que forman parte de la microbiota intestinal, aunque tengan menor dosis de fagos (Tabla 4).

Sin embargo, aún faltan más estudios que evalúen el recuento bacteriano post tratamiento de la cepa bacteria objetivo, dado que la mayoría de los trabajos evalúan solamente los géneros bacterianos, microbiota intestinal y en menor medida la excreción, que se ha estudiado para controlar la transmisión horizontal.

Del mismo modo, los fagos han demostrado sinergismo al emplearse junto a los probióticos y ser más efectivos que estos al reducir las bacterias patógenas (^{Gebru et al., 2010}; ^{Kim et al., 2014}; ^{Kim et al., 2017}). En tal sentido, se debería comparar con otras alternativas como prebióti cos, aceites esenciales y ácidos orgánicos como se reali zaron en otras especies animales y el efecto sobre el tamaño de vellosidades intestinales y profundidad de criptas.

Tabla 4 Efectos bacteriófagos sobre microbiota (log10 UFC/g) de aves 

Los tratamientos dietéticos fueron dieta basal sin ningún antimicrobiano (C) y dieta basal suplementada con bacteriófago (B). ²SEM: error estándar.

Tabla 5 Efectos de cocteles de bacteriófagos sobre parámetros productivos de aves suministrados en el alimento 

¹Los tratamientos dietéticos fueron dieta basal sin ningún antimicrobiano (C) y dieta basal suplementada con cóctel de bacteriófago (B).

GP: ganancia de peso promedio, CP: consumo de alimento promedio. ²SEM: error estándar.

Tabla 6 Efectos de bacteriófagos y antibióticos sobre microbiota intestinal (log10 UFC/g) 

Los tratamientos dietéticos fueron dieta basal sin ningún antimicrobiano (C), dieta basal suplementada con antibióticos (A) y dieta basal suplementada con cóctel de bacteriófago (B). ¹SEM: error estándar.

7. Efecto de los fagos sobre los parámetros productivos

Los cocteles de fagos han mostrado efectos positivos sobre los parámetros productivos en pollos de engorde y gallinas de postura comercial. Según los estudios realizados, los cocteles mixtos tienen mejores resultados sobre la conversión alimenticia que los cocteles simples, existiendo diferencia estadística, incluso cuando la dosis de cocteles simples es mayor; además, los bacteriófagos aumentaron la producción y peso de huevos en las primeras semanas de producción de gallinas de postura comercial mostrando diferencia estadística (Tabla 5). Según lo expuesto en los capítulos anteriores, se puede decir que fagos influyen indirectamente sobre los parámetros productivos al reducir las bacterias potencialmente patógenas y favorecen la multiplicación de las bacterias benéficas, lo que resulta en un mejor aprovechamiento de los nutrientes y que estos efectos pueden potenciar al usar fagos protegidos y en mayores dosis.

8. Comparación entre fagos y promotores de crecimiento tipo antibióticos

Los trabajos realizados en aves demostraron que los bacteriófagos son más eficaces que los antibióticos al disminuir sólo las bacterias patógenas (^{Wang et al., 2013}; ^{Kim et al., 2014}); no obstante, se observó mejores resultados con cocteles mixtos de fagos, debiéndose no sólo a la reducción de la población de bacterias patógenas objetivo, sino también a la multiplicación de las bacterias benéficas (Tabla 6). Adicionalmente, los fagos son una buena alternativa contra bacterias resistentes a los antibióticos ya que los fagos utilizan mecanismos distintos a estos fármacos, sin embargo, falta realizar más estudios con mayores dosis de cocteles de fagos como los que utilizan actualmente y emplear fagos protegidos.

Una ventaja de los bacteriófagos frente a los antibióticos es que las bacterias resistentes a los antibióticos no pierden su capacidad de generar daño (virulencia), mientras que las bacterias resistentes a los fagos pueden ser menos virulentas (^{Laanto et al., 2012}; ^{Castillo et al., 2015}; ^{Castillo et al., 2018}). Dado que, los receptores de la superficie celular de las bacterias patógenas actúan como factores de virulencia, por lo que, al modificarlos para desarrollar fago-resistencia reduce su virulencia. Sin embargo, la desventaja frente a los antibióticos sigue siendo el menor espectro de acción, por lo cual se propone el uso de cocteles mixtos de fagos líticos para aumentarlo. Los fagos pueden ser utilizados como promotores de crecimiento en los momentos críticos como el despique, vacunación (siempre que no se trate de vacunación contra bacterias) y traslado que afectan el consumo de alimento; y con ello evitar el aumento de bacterias potencialmente patógenas, que afectan negativamente los parámetros productivos.

9. Autofagos

En el mercado existen muchos productos comerciales (Tabla 7) cuyo principio activo son cocteles simples de fagos líticos. La mayoría de estos productos proceden de países europeos, asiáticos y norteamericanos, que tienen realidades y desafíos diferentes. Lo anterior, sumado a la cantidad de serovares (^{Pulido-Landínez, 2013}; ^{Guibourdenche et al, 2017}; ^{Moawad et al., 2018}) presentes en los centros avícolas y la alta especificidad de los bacteriófagos, reduce la probabilidad de encontrar un producto comercial cuyo espectro incluya las bacterias presentes en un centro productivo determinado. En esta situación, existen tres posibilidades: que todas, algunas o ninguna de las bacterias presentes en una granja comercial formen parte del espectro del producto comercial. Por tal motivo, antes de adquirir un producto comercial, la empresa avícola debe asegurarse que las bacterias presentes en la granja sean susceptibles al producto comercial. Además, deben considerar que se trate de cocteles de fagos líticos protegidos y aún mejor si son cocteles contra múltiples géneros bacterianos (cocteles mixtos).

Por otro lado, el uso de autofagos es una alternativa de solución cuando un producto comercial no muestra los efectos deseados, donde se denomina autofago (AP) a un bacteriófago que fue aislado del mismo entorno donde se encontró el patógeno (^{Sevilla-Navarro et al, 2018}). Lo cual implicaría la implementación adecuada de los laboratorios de las granjas para el aislamiento y amplificación de dichos autofagos y considerar las recomendaciones expuestas en este artículo. Incluso, las granjas avícolas pueden ampliar este concepto y buscar fagos en aguas residuales de diferentes centros avícolas.

10. Conclusiones

En el presente trabajo se ha descrito a los bacteriófagos líticos como excelentes sustitutos de antibióticos como promotores de crecimiento en avicultura. Dado que, estudios experimentales demostraron su capacidad para reducir la mortalidad en aves desafiadas con bacterias patógenas y mejorar los parámetros productivos. Así mismo, se ha justificado la necesidad de protegerlos, la utilización de cocteles de fagos líticos para combatir la fago-resistencia y el uso de cocteles mixtos para aumentar el espectro. Por lo tanto, la utilización óptima en avicultura comercial es mediante cocteles mixtos de fagos líticos protegidos. Finalmente, existen productos comerciales, sin embargo, es necesario que se elaboren cocteles mixtos de fagos líticos protegidos y que sean personalizados según los desafíos de cada granja; por lo cual, los autofagos son una alternativa cuando los productos comerciales no muestran los efectos deseados.