Español (pdf)
Articulo en XML
Referencias del artículo
Traducción automática
Enviar articulo por email
Citado por SciELO 
Similares en
SciELO 
Permalink
1. Introducción
El cultivo de arveja (Pisum sativum L.) conocido también como guisante o chícharo, forma parte de la dieta alimenticia de la población peruana y del mundo, se consume como grano fresco, cuyo contenido de proteínas es de 7% y como grano seco contiene 21% (Camarena et al., 2014). Además, posee minerales como Ca, Fe, P, Zn, K, Mg, y son una excelente fuente de vitaminas A, B1 y C. Así mismo, su alto contenido de fibra permite la reducción de colesterol y la regulación del azúcar en la sangre (Maiza et al., 2015; Watson et al., 2017). El cultivo se adapta mejor en climas templados como los valles interandinos, sembrándose hasta los 3,300 msnm (Camarena et al., 2014). También, esta leguminosa se cultiva en la mayoría de las zonas altas de los trópicos del mundo como China, India, Estados Unidos, Francia, Reino Unido y Brasil (Liu et al., 2016; Owati et al., 2019; Bellé et al., 2020). En el Perú, las zonas productoras de arveja se encuentran en los departamentos de Cajamarca, Ancash, Junín, Huancavelica, Arequipa, Cusco, Lambayeque y Piura (Valladolid-Chiroque, 2016). En Piura, la provincia de Huancabamba es la principal zona productora de arveja, siendo la variedad criolla la más comercializada en el mercado local y es la principal fuente de ingreso económico de los agricultores. En los últimos años el área cultivada de arveja en Piura se ha incrementado desde 396 ha (2018) hasta 545 ha (2019) (MINAGRI, 2019). Sin embargo, el cultivo es afectado por la enfermedad de la antracnosis, cuyos síntomas son manchas necróticas en el tallo, hojas y vainas y es la responsable de importantes pérdidas económicas. Liu et al. (2016) en China, Tadja et al. (2018) en Argelia, Owati et al. (2019) en Montana, Estados Unidos, Jevtic et al. (2019) en Bosnia y Herzegovina y Bellé et al. (2020) en Brasil, reportan que la enfermedad de la antracnosis o tizon de ascochyta es devastadora en el cultivo de arveja, y que es causado por un complejo de hongos que llegan a ocasionar pérdidas en el rendimiento entre 20% a 50% de la producción. Por otro lado, Dias et al. (2016) y Rogério et al. (2019) manifiestan que la antracnosis en diferentes cultivos es un sistema complejo, para implementar un programa de manejo integrado de control, se debe de conocer la identidad del agente causal, ciclo de vida, diversidad genética, recombinación sexual de los patógenos, efecto de fungicidas y epidemiología; en el Perú existe poca información disponible. Por la importancia de la enfermedad y el desconocimiento de la etiología, se realizó el presente trabajo de investigación y se plantearon como objetivos describir la sintomatología, identificar los agentes causales y evaluar el efecto de los fungicidas in vitro frente a los hongos fitopatógenos aislados e identificados.
2. Materiales y métodos
2.1 Muestreo y recolección
Se recolectaron plantas y vainas de arveja con síntomas de antracnosis de diferentes parcelas de arveja de las comunidades y caseríos de la provincia de Huancabamba (Hbba), departamento de Piura (Tabla 1), que se encuentra ubicado a una altitud de 2538 msnm, las condiciones climáticas promedios que se registraron fueron 18,5 °C, 80,6% de humedad relativa y 581,3 mm de precipitación anual. Las muestras debidamente codificadas se colocaron en bolsas de papel kraft y fueron llevadas al laboratorio para su análisis. El trabajo se realizó en el laboratorio de Fitopatología de la Universidad Nacional de Piura.
2.2 Aislamiento e identificación de hongos
A partir de muestras de campo con síntomas de antracnosis, se cortaron porciones de tejido infectado de aproximadamente 3*3 mm (región comprendida entre tejido sano y enfermo) esto fueron desinfestadas con una solución de NaOCl al 1% por un minuto, se enjuagaron dos veces con agua destilada, secadas con papel toalla estéril y sembradas en placas de Petri conteniendo medio de cultivo PDA más estreptomicina (50 mg). Las placas sembradas fueron cubiertas con parafilm e incubadas a 19 ± 1 °C (Rubiales et al., 2018) hasta obtener el crecimiento del hongo y luego, se realizaron siembras sucesivas hasta obtener el cultivo puro. Los aislamientos purificados fueron entubados e incubados en refrigeración a 5 °C con la finalidad de mantener la viabilidad y patogenicidad (French & Hebert, 1980; Padder et al., 2012).
La identificación se realizó a través de la clave propuesta por Sutton (1980). Se prepararon montajes para observar a través del microscopio compuesto con aumento de 40X (Carl Zeiss Mod. KF 2, Oberkochen, Germany) las características morfométricas de las estructuras asexuales de los aislamientos. Asimismo, se observó y se describieron las características culturales de los aislamientos, como crecimiento y desarrollo micelial, borde y coloración de la colonia.
2.3 Prueba de patogenicidad
La prueba de patogenicidad se realizó de acuerdo con los postulados de Koch (Agrios, 1995; Bellé et al., 2020). Se emplearon vainas de arveja var. criolla, se desinfectaron con NaOCl al 1% por un minuto, se enjuagaron con agua destilada estéril y luego fueron colocadas sobre papel toalla estéril para su secado. La inoculación se realizó en la superficie de las vainas con discos de medio PDA de 7 mm de diámetro más el desarrollo micelial de los hongos, empleándose diez vainas por cada aislamiento. Las vainas inoculadas se colocaron en bandejas plásticas transparentes y herméticas de 20*30 cm e internamente estuvieron cubiertas con papel toalla húmeda y se incubaron a 19 ± 1 °C por diez días. La evaluación se realizó diariamente (Rubiales et al., 2018).
2.4 Efecto de fungicidas in vitro
Se realizó mediante la técnica del medio de cultivo envenenado (French & Helbert,1980), los fungicidas de acuerdo a la dosis de los tratamientos (Tabla 2), se agregaron a erlenmeyers que contenían medio de cultivo PDA a punto de plaqueo (45 a 50 °C), los cuales se agitaron, obtenida la mezcla fue vertida 20 mL a las placas de Petri estériles y se dejó solidificar; sobre ello se sembraron discos de agar de 6 mm de diámetro más el desarrollo micelial de los aislamientos fúngicos, teniendo cuidado de poner en contacto el micelio del hongo con la superficie del medio envenenado. El tratamiento testigo solo contenía medio PDA sin fungicidas. Las placas sembradas fueron incubadas a 19±1 °C (Rubiales et al., 2018). Para las evaluaciones, en la base de las placas se marcó dos líneas perpendiculares entre sí, en cada extremo de las líneas se escribió letras a-b y c-d y se realizaron mediciones diarias del diámetro (cm) del crecimiento micelial de los hongos. Las evaluaciones culminaron cuando el testigo cubrió toda la superficie del medio (Padder et al., 2012). La eficacia de los fungicidas se determinó por cálculo del porcentaje de inhibición en el crecimiento micelial de la colonia usando la siguiente fórmula:
Inhibición (%) = (C-T/C)*100 (donde T: crecimiento micelial (cm) del diámetro en cada tratamiento; y C: crecimiento micelial del diámetro en el testigo).
2.5 Diseño estadístico
Se empleó el Diseño Completamente al Azar (DCA) con nueve tratamientos (ocho fungicidas y un testigo) con cuatro repeticiones (Tabla 2), los resultados se sometieron al análisis de varianza (ANVA) y a la prueba de comparación de medias de Tukey (α = 0,05), los datos se procesaron en el programa SAS (Statistical Analysis System).
3. Resultados y discusión
3.1 Sintomatología
En hojas de arveja C. truncatum y C. lindemuthianum produjeron manchas necróticas de forma redondeada a irregulares de color marrón, rodeadas de un halo de color amarillo (Figura 1A), al inicio se presentó en las hojas del tercio inferior, luego fue avanzando hasta alcanzar al tercio medio, estos síntomas coinciden con lo reportado por Bellé et al. (2020) ocasionado por C. coccodes en hojas de arveja. En las vainas se observaron manchas necróticas redondeadas, oblongas y hundidas, con borde marrón oscuro y en las manchas necróticas se observó la formación de pequeños cuerpos fructíferos de reproducción asexual llamados acervulos y esporulación de conidias de coloración salmón (Figura 1B). Padder et al. (2017) indican que las salpicaduras del agua de lluvia dispersan las conidias de C. lindemuthianum y provocan la propagación de la enfermedad. En ataques severos se observó necrosis en la cáscara y las semillas presentaron manchas necróticas (Figura 1C). Al respecto Sivachandra-Kumar and Banniza (2017) y Rodríguez-Ortega et al. (2018) manifiestan que las semillas de arveja y frijol se comportan como fuentes de inóculo de la enfermedad y son la principal vía de diseminación a grandes distancias. Esto se corrobora con Sewedy et al. (2019) quienes en semillas de frijol y soya encontraron a C. lindemuthianum y C. dematium. Las condiciones ambientales registradas durante la investigación, como temperatura media de 18,5 °C, humedad relativa media de 81,6% y precipitación anual de 581,3 mm, fueron favorables para el desarrollo de la antracnosis en Hbba.
Tabla 2 Evaluación de fungicidas in vitro para el control de hongos asociados a la antracnosis en el cultivo de Pisum sativum L.
| Tratamientos | Fungicidas | Ingrediente Activo | Dosis (g o mL/100 mL) |
| T1 | Antracol 70 PM | Propineb | 0,25 |
| T2 | Cupravit 21 PM | Oxicloruro de Cu cobre | 0,30 |
| T3 | Rovral PM | Iprodione | 0,20 |
| T4 | Stroby DF | Kresomix-metil | 0,03 |
| T5 | Nativo WP | Tri+tebuconazole | 0,10 |
| T6 | Horizon 25 WP | Tebuconazole | 0,10 |
| T7 | Sportak 450 EC | Procloraz | 0,04 |
| T8 | Sancozeb WP | Mancozeb | 0,25 |
| T9 | Testigo | Agua destilada | 0,00 |
Tri=Trifloxystrobin.
Estos resultados coinciden con otros trabajos como lo reportado por Rodríguez-Ortega et al. (2018), que señalan que el hongo C. lindemuthianum infecta con mayor frecuencia al frijol cuando la temperatura oscila de 13 a 26 ºC y HR mayor a 80% y He et al. (2016) y De-Silva et al. (2017) quienes afirman que C. truncatum es un hongo fitopatógeno importante que infecta varios cultivos y prospera en zonas templadas y húmedas del mundo. Los síntomas observados en campo son el resultado de la acción de varias enzimas como la cutinasa que son segregados por los fitopatógenos para romper la cutícula y penetrar en forma directa a su hospedante (Agrios, 1995; Auyong et al., 2015). Armesto et al. (2019) detectaron enzimas como la Poligalacturonasas (PG) en C. gloeosporioides y observaron mayor intensidad de antracnosis en café. Esto nos indica que existe una relación entre las PG de los hongos fitopatógenos y la patogenicidad en el hospedante (Nakamura & Iwai, 2019). Asimismo, se demostró que el gen pecCl1 de C. lindemuthianum está involucrado en la virulencia del patógeno (Cnossen-Fassoni et al., 2013).
Figura 1 Sintomatología por Colletotrichum spp. en arveja A) lesiones necróticas en las hojas B) en vainas se observó manchas necróticas hundidas de forma ovalada y redondeada C) manchas necróticas en semillas D) acervulos del hongo C. truncatum inmersos en las manchas necróticas en las vainas E) Acervulos con varias setas, observadas en el microscopio compuesto (40x).
La antracnosis es una enfermedad destructiva y responsable de pérdidas significativas de rendimiento en pimiento, tomate, papaya, mango, leguminosas y frutales (Liu et al., 2016; He et al., 2016; Torres-Calzada et al., 2018; Almaraz et al., 2019). Además, los tallos y vainas infectadas de frijol por C. lindemuthianum pueden sobrevivir de 9 a 18 meses en el suelo, por lo que es importante eliminar los restos de tejido infectado y realizar rotación de cultivos con gramíneas (Conner et al., 2019). Los síntomas observados en las vainas de arveja ocasionados por C. truncatum y C. lindemuthianum son iguales, ambos causaron lesiones necróticas hundidas con centro pajiso con borde de coloración marrón oscura y formación de acervulos (Figura 1D).
A. pisi ocasionó necrosis en hojas, tallos y vainas; en hojas presentó manchas necróticas de forma redondeada a irregulares de coloración marrón, como síntoma avanzado se observó amarillamiento, defoliación y necrosis de las hojas. En tallo se observó manchas necróticas ubicadas en sentido longitudinal de tamaño variable (Figura 2A). En vainas se presentaron manchas necróticas hundidas de forma ovalada a circulares con borde de coloración marrón oscuro (Figura 2B); en las manchas necróticas se observó la formación de cuerpos fructíferos llamados picnidios y no se observaron síntomas en las flores de arveja. En países como China, Argelia, Estados Unidos, Canadá, Bosnia, entre otros, la enfermedad es conocida como tizón de Ascochita, ocasionado por Ascochyta pisi, Phoma medicaginis (A. pinodella) and Mycosphaerella pinodes (A. pinodes), estos patógenos producen lesiones necróticas en hojas, tallos, flores y frutos de arveja ocasionando reducción del rendimiento (Liu et al., 2016; Tadja et al., 2018; Owati et al., 2019; Jevtic et al., 2019). Riccioni et al. (2019) indican que el tizón de Ascochyta en arveja es una enfermedad importante a nivel mundial y es una gran amenaza en la agricultura orgánica.
3.2 Aislamiento e identificación de hongos
A partir de cultivos monospóricos se obtuvieron 18 aislamientos, nueve fueron identificados como Colletotrichum truncatum (Sacc. & Magn.), seis C. lindemuthianum (Schwein) y tres Ascochyta pisi (Berk). Los hongos identificados se aislaron a partir de las vainas infectadas.
3.2.1 Características culturales y morfométricas
En medio de cultivo PDA, el hongo C. lindemuthianum desarrolló micelio semirastrero de coloración cremoso con margen uniforme, luego a los cuatro a seis días formó anillos concéntricos alrededor del disco de siembra, en cada anillo se observó masas conidiales de coloración naranja (Figura 3A). Las conidias fueron unicelulares, hialinas de forma cilíndrica obtusa en los ápices (Figura 3B), con un tamaño osciló de 9,5 - 11,5 x 3,5 - 4,5 μm LxA, los apresorios fueron esféricos a obclavadas, pálidos a marrón oscuro de 8 x 6 - 7 μm, las características, según la clave de Sutton (1980) coinciden para la especie C. lindemuthianum.
Rodríguez-Guerra et al. (2005) en México, observaron peritecios con asca y ascosporas de Glomerella lindemuthiana (fase sexual) de C. lindemuthianum (fase asexual) en frijol, por lo que taxonomicamente pertenece a la clase Ascomycetes.
Figura 3 A) C. lindemuthianum, micelio con crecimiento superficial y semirastero, esporulación de color salmon B) conidias unicelulares hialinas de forma cilíndrica obtusa en los ápices, observados en el microscopio compuesto (40x).
C. truncatum desarrolló colonias algodonosas de color crema tornándose a negruzco en el centro de la colonia, el crecimiento fue lento, con borde irregular y redondeado (Figura 4A). En medio PDA se observó la formación de masas conidiales de coloración naranja. Los conidióforos fueron cortos y simples, las conidias fueron de forma falcada con los ápices obtusos, unicelulares, hialinas, con presencia de glútulas en su interior, cuyo tamaño promedio fue de 15,5 - 24 x 3,5 - 4 μm LxA (Figura 4B). Los apresorios fueron de forma obclavada a circulares de 11 - 16 x 8 - 9,5 μm, de coloración marrón oscuro. El tamaño de las conidias y apresopios observados en el presente trabajo coincide con los reportes de Almaraz et al. (2019) para C. truncatum aislado del tomate. Los acervulos fueron de color oscuro, con 10 a 15 setas tabicadas (Figura 1E), largas con un tamaño promedio de 144 μm y delgadas que sobresalieron claramente sobre la masa de conidias. Las características culturales y morfológicas observadas coinciden para la especie C. truncatum según la clave de Sutton (1980). La fase sexual de C. truncatum es Glomerella truncata (Armstrong-Cho & Banniza, 2006). Apartir de la recombinación sexual de los hongos, se genera una mayor diversidad genética de una población (Moges et al., 2016).
Figura 4 A) C. truncatum, colonia algodonosa con borde irregular y pigmentación oscura en el centro B) conidias de forma falcada, hialianas y unicelulares, visto por microscopio compuesto (40x).
En medio PDA, A. pisi desarrolló micelio algodonoso semirastrero de color blanco cremoso, a los seis a ocho ddi se fue tornando de color negro el centro de la colonia (Figura 5A) y a los diez ddi se observó la formación de cuerpos fructíferos asexuales (picnidios) inmersos en el medio de cultivo. Estos cuerpos fructificantes fueron de forma esférica, de color gris, con un tamaño promedio de 100 μm de diámetro (Figura 6) y se encontraron distribuidos en pequeños grupos en toda el área y conglomerados sobre la superficie de los discos de siembra. Los conidióforos simples midieron 7 - 10 x 5 - 8 μm, las conidias fueron de forma cilíndrica, oblonga a elipsoide, algunas de forma ovoide con un tamaño promedio de 12,3 x 3,6 μm de LxA, generalmente bicelulares y algunas unicelulares (Figura 5B). Estas características determinadas según la clave de Sutton (1980) corresponde a la especie Ascochyta pisi. Asimismo, coincide con los resultados obtenidos por Tadja (2018) que reporta en Argelia a A. pisi como el agente causante del tizón de Ascochyta. Por otro lado, Owati et al. (2019) y Jevtic et al. (2019) identificaron como Didymella pisi la fase sexual de A. pisi. D. pisi es un hongo heterotalico y en una recombinación sexual puede aparecer nuevos genotipos con características muy virulentas que los progenitores (Taylor et al., 2017).
Figura 5 Hongo Ascochyta pisi A) en placas de Petri con medio PDA desarrolló colonia algodonosa de coloración blanco cremoso con pigmentación grisácea en el centro, B) conidias de forma cilíndrica, oblongas y bicelulares en su mayoría.
3.2.2 Prueba de patogenicidad
En las vainas de arveja inoculadas con los aislamientos C. lindemuthianum, C. truncatum y A. pisi a los tres días después de la inoculación (ddi) se reprodujeron los síntomas de necrosis, a los cuatro ddi se observó desarrollo micelial algodonoso en la zona de inoculación, luego, a los seis ddi en la lesión necrótica se observó esporulacion de color naranja inoculadas con C. lindemuthianum y C. truncatum, y a los ocho ddi se observó la formación de picnidios del hongo A. pisi (Figura 7). Los resultados obtenidos coinciden con los trabajos anteriores de Rojo-Baez et al. (2017a) y Rojo-Báez et al. (2016) quienes en frutos de papaya inoculadas con C. truncatum observaron los primeros sintomas a los tres (ddi) y los acérvulos a los 5 ddi; y en arveja a los 4 ddi. Asimismo, Rojo-Báez et al. (2017b) reportan que C. gloeosporioides y C. truncatum poseen amplio rango de hospedantes y que su colonización es intramural subcuticular e intracelular. Estos resultados nos muestran que debemos de implementar diferentes estrategias de manejo de la enfermedad.
3.2.3 Efecto de fungicidas in vitro
En la Tabla 2 se presenta los resultados del efecto de los fungicidas, según las comparaciones de medias múltiples de Tukey (α ≤ 0,05) hubo diferencia estadística entre los tratamientos evaluados. Los fungicidas tebuconazole, trifloxystrobyn+tebuconazole, procloraz y mancozeb, inhibieron en un 100% el crecimiento micelial de los hongos C. lindemuthianum, C. truncatum y A. pisi superando significativamente (α ≤ 0,05) al testigo y a los otros tratamientos. Latorre (1989) y Mont (2002) indican que mancozeb es un ditiocarbamato que interfiere los compuestos metabólicos de la respiración de los hongos, procloraz y tebuconazole son triazoles que alteran la membrana protoplasmática de los Ascomycetos y Deuteromycetos. La estrobilurina y triazol, inhiben la respiración y la biosíntesis de ergosterol de los hongos, probablemente todos estos mecanismos de acción hayan influenciado en la inhibición al 100% del crecimiento micelial de los hongos. Resultados similares fueron obtenidos por Sewedy et al. (2019) quienes al combinar iprodione+ tebuconazole lograron inhibir en un 90% el crecimiento micelial de los hongos C. lindemuthianum y C. dematium. Mientras que Dias et al. (2016) redujo la incidencia de antracnosis en soya ocasionada por C. truncatum con la aplicación de los fungicidas azoxistrobina+ciproconazol. McCreary et al. (2016) y Boersma et al. (2020) obtuvieron menor severidad de pudricion de raíces y corona ocasionada por Sclerotinia sclerotiorum y antracnosis en frijol (C. lindemuthianum) con la aplicación de estrobilurina, fluazinam y tiofanato de metilo. Para evitar la resistencia a fungicidas, se recomienda rotar las aplicaciones de productos con diferentes modos de acción, para maximizar la vida útil y la eficiencia de los principios activos, garantizando la sustentabilidad económica y ambiental (Kitchen et al., 2016; Carmona & Sautua, 2017; Boersma et al., 2020). Al conocer los agentes causales, su biología, su etiología, nos ayuda a implementar algunas medidas preventivas de control. Según, Rojo-Báez et al. (2016) recomiendan emplear semillas libres de enfermedad, rotación de cultivos, remoción de tejidos infectados y fungicidas permitidos. Otra alternativa de control es la propuesta por Landero-Valenzuela et al. (2016); Liu et al. (2016) y Shafique et al. (2017) con aplicaciones de extractos vegetales y Bacillus subtilis redujeron el crecimiento de los hongos del tizón de ascochyta y la severidad de antracnosis en frutos de papaya, palto y mango por el ataque de Colletotrichum spp.
4. Conclusiones
La caracterización fenotípica nos permitió determinar que los agentes causales de la antracnosis en el cultivo de arveja son Colletotrichum lindemuthianum, C. truncatum y Ascochyta pisi y los fungicidas tebuconazole, trifloxystrobin+tebucanazole, procloraz y mancozeb inhibieron completamente el crecimiento micelial de los hongos. Trabajos futuros deben utilizar técnicas moleculares para identificar los hongos asociados a la antracnosis e implementar diferentes estrategias de manejo de la enfermedad.
