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Scientia Agropecuaria

versión impresa ISSN 2077-9917

Scientia Agropecuaria vol.10 no.1 Trujillo ene./mar. 2019

http://dx.doi.org/10.17268/sci.agropecu.2019.01.09 

ARTÍCULOS ORIGINALES

Composición química y actividad biológica de la secreción larval de la especie Phoracantha recurva Newman, 1842 (Coleóptera: Cerambycidae)

Chemical composition and biological activity of the larval secretion of the species Phoracantha recurva Newman, 1842 (Coleoptera: Cerambycidae)

 

Luis Jesús Reyes-García1,*; Pia Francisca Cid Oyanedel2; Pamela Fernanda Cuevas Catalan3

1 Facultad de Ciencias Básicas, Universidad Santo Tomás, Limonares 190, Viña del Mar, Chile.

2 Instituto de Química, Pontificia Universidad Católica de Valparaíso. Avda. Universidad 330, Curauma, Valparaíso, Chile.

3 Escuela de Tecnología Médica, Universidad Santo Tomás, Limonares 190, Viña del Mar, Chile.


Resumen

La especie Phoracantha recurva (Coleóptera: Cerambycidae) es una plaga que en su etapa larval ataca principalmente plantaciones de eucaliptus. Con la finalidad de documentar un perfil de los compuestos que secreta la larva de este insecto y analizar su actividad biológica, hemos identificado los componentes presentes en el extracto metanol/cloroformo mediante cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas. Se encontraron 41 compuestos, varios de los cuales han sido identificados en la especie hospedera. Se utilizó un olfatómetro para analizar las respuestas olfativas de hormigas (Camponotus morosus) hacia ejemplares de larvas de P. recurva y distintas dosis de sus secreciones. Los resultados obtenidos sugieren que la secreción larval actúa como repelente de las hormigas. Los resultados se discuten en vista de la información existente.

Palabras clave: GC-MS; composición larval; bioensayos; escarabajo taladrador del eucalipto; respuestas olfativas.


Abstract

The species Phoracantha recurva (Coleóptera: Cerambycidae) is a plague that, in its larval stage, mainly attacks eucalyptus plantations. In order to document a profile of the compounds secreted by P. recurva larvae and analyze their biological activity, we identified the components pres ent in the methanol/chloroform extract by gas chromatography/mass spectrometry. 41 compounds were found, several of which have been identified in the host species. An olfactometer was used to analyze the olfactory responses of ants (Camponotus morosus) to the P. recurva larvae and different doses of their secretions. The results suggest that the larval secretion repels the ants. The 79results are discussed in view of the existing literature.

Keywords: GC-MS; larval composition; bioassays; longhorned borer beetle; olfactory responses.


1. Introducción

El género Phoracantha (Coleóptera: Cerambycidae) es originario de Australia y Nueva Guinea y presenta dos especies en Chile: Phoracantha semipunctata Fabricius y Phoracantha recurva Newman. En su etapa larval esta especie ataca a distintas especies de eucaliptus, los que constituyen uno de los grupos forestales de mayor importancia económica en Chile (Özdikmen, 2017), en un principio el daño lo realiza superficialmente, sin embargo, luego se internan en la madera generando galerías de alimentación de hasta 10 mm de diámetro, lo cual provoca el debilitamiento y finalmente la muerte del árbol (Dhahri et al., 2016; Paine y Lieutier, 2016). Phoracantha recurva ha sido reportada en Chile en las regiones de Valparaíso y Metropolitana y presenta varios enemigos naturales que han sido utilizados en su control biológico (Branco et al., 2015). La duración del periodo larva-adulto es cercano a los 300 días, mientras que la duración en la etapa adulta es de aproximadamente 90 días (Suma, 2018). Varias especies pertenecientes al orden coleóptera, en su etapa larval producen compuestos en glándulas dorsales y son emitidos como mecanismo de defensa cuando es atacado (Hölldobler, 2018). Los compuestos presentes en la secreción de la larva P. Recurva no han sido estudiados anteriormente, en este trabajo hemos identificado los componentes presentes en el extracto metanol/cloroformo mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GCMS). Los compuestos presentes en los extractos se identificaron por comparación de los patrones de fraccionamiento de masa, índices de retención, reacciones de derivatización y por comparación con compuestos sintéticos utilizados como referencia.

La actividad repelente de los compuestos de la secreción de larvas se probó en bioensayos de laboratorio con hormigas (Camponotus morosus) utilizando un olfatómetro en Y. Los resultados obtenidos sugieren que las larvas emiten compuestos que actúan como repelente de las hormigas. Los resultados se discuten en vista de la información existente.

2. Materiales y métodos

2.1 Insectos

Las larvas de P. recurva se colectaron en eucaliptos spp en los alrededores de Quilpué, Valparaíso (33o 4’ S 71º 25’ W) V región, entre los periodos diciembre 2016 y mayo 2017, fueron mantenidas en cámara climática (25 ± 1 ºC; 16L: 8D; 50 ± 5% humedad relativa) y alimentadas con madera y hojas de eucaliptus. Las larvas fueron identificadas de acuerdo a sus características morfológicas (Paine y Lieutier, 2016). Una vez emergidos los adultos, se confirmó la identificación de la especie de acuerdo a las características morfológicas descritas en la literatura (Valladares et al., 2017).

2.2 Compuestos de referencia

Todos los reactivos químicos y disolventes fueron adquiridos en Merck (Darmstadt, Alemania) o Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). Los compuestos de referencia (metil esteres de ácidos grasos, FAME) se adquirieron en Supelco (37 componentes FAME Mix, nº de catálogo CRM47885).

2.3 Extractos

El extracto crudo de larvas se preparó por maceración en hexano de acuerdo la metodología descrita por Teh et al. (2017).

2.4 Formación de metil esteres

A un extracto de 5 larvas en 2 mL de diclorometano se le agregó 2 mL de BF3-MeOH y se dejó a 60°C por 2 h. Una vez transcurrido este tiempo, la solución fue lavada con agua destilada, se extrajo con hexano (2x1 mL), se secó con Na2SO4 y se concentró con un flujo suave de nitrógeno. La solución se almacenó a -20°C para su posterior análisis por GC-MS.

2.5 Derivatización de los extractos con disulfuro de dimetilo (DSDM)

A 50 µL de extracto en hexano se le agregó 25 µL de una solución de Yodo (5% en dietil éter) y 50 µL DSDM, se dejó a 50 °C por 4 h. Una vez transcurrido este tiempo se le agregó tiosulfato de sodio al 10%. La fase orgánica fue secada con Na2SO4 anhidro, concentrada con un flujo suave de nitrógeno y posteriormente analizada por GC-MS.

2.6 Análisis Cromatográfico

El análisis por cromatografía gaseosa (GC) se realizó utilizando un equipo Shimadzu GC-2014AFSC con un detector de ionización de llama (FID) y equipado con una columna capilar de silica fundida RTX-Wax (30 m x 0,32 mm diámetro interno, 0,25 m film, Restek), las condiciones fueron 50 ºC, 2 min a 10 ºC min-1 hasta 220 ºC. El GC fue operado en modo splitless con un inyector de temperatura 250 ºC. El análisis por GCMS se realizó utilizando un equipo Shimadzu GCMS-QP2010 Ultra, equipado con una columna RTX-5 (30 m x 0,25 mm diámetro interno, 0,25 m film, Restek, Bellefonte, PA, USA), el programa utilizado fue a 50 ºC por 5 min hasta 270 ºC a 8 ºC∙ min-1. El espectro de masas fue adquirido a 70 eV y el GC se trabajó en modo splitless con un inyector de temperatura de 250 ºC. En ambos equipos se utilizó helio como gas transportador. Los picos se identificaron de acuerdo a su patrón de fraccionamiento de masas, tiempo de retención, por comparación con la librería de espectros NIST y con datos espectroscópicos disponibles en la literatura.

2.7 Bioensayos

Larvas en su último estadio (Paine y Liutier, 2016) fueron mantenidas individualmente bajo condiciones de bioensayo (20 °C) 1 hora antes del ensayo. Para los ensayos de comportamiento se utilizó como olfatómetro un tubo en Y de vidrio (7,0 mm diámetro interno, brazos de 5 cm) acoplado a dos contenedores de vidrio de 250 mL mediante tubos de teflón (8 mm diámetro interno, 40 cm de longitud). El tubo en Y se utilizó de forma horizontal y se suministró aire filtrado con carbón activado a una velocidad aproximada de 1,5 l∙min-1. En el primer experimento uno de los contenedores de vidrio contenía el estímulo (larvas) y el otro contenedor solo aire. En el segundo experimento se puso papel filtro con extracto y como blanco se utilizó papel filtro tratado con solvente. Se colocó una única hormiga en la base del tubo olfatométrico, su comportamiento fue observado durante 7 min y se registró su elección. Las hormigas que no hicieron elección fueron excluidas del análisis estadístico. La fuente de estímulo fue rotada para evitar el sesgo posicional y el olfatómetro fue lavado cada 5 ensayos. Las respuestas de las hormigas fueron ensayadas con los siguientes estímulos:

2.7.1 Respuesta hacia larvas

10 o 1 larvas fueron separadas 60 min antes de comenzar los ensayos y se colocaron en el recipiente de vidrio.

2.7.2. Respuesta hacia extractos dicloro-metánicos

Un papel de filtro de 2 × 2 cm se cargó con 120, 12 o 1,2 mg de extracto (correspondiente a 10, 1 o 0,1 extracto de larva equivalente (ELE) respectivamente. 1 ELE es la cantidad de extracto que se obtiene a partir de 1 larva en diclorometano. El papel filtro se puso en el recipiente una vez evaporado el solvente. Cada papel filtro se utilizó en 5 ensayos. Los datos fueron analizados con una prueba binomial para evaluar la significancia estadística.

3. Resultados y discusión

Larvas mantenidas con madera y hojas de eucaliptus por una semana fueron investigadas. El cromatograma de las secreciones se muestra en la Figura 1.

Los compuestos obtenidos producto de la metanólisis fueron identificados por comparación con estándares de referencia (ver materiales y métodos). Una lista con la identificación de los compuestos es dada en la Tabla 1.

Todos los metil ésteres saturados presentaron el fragmento m/z M+ y m/z 74 (pico base) producido por un reordenamiento de McLafferty en los metil esteres (Maulidiyah et al., 2017). En el espectro de masas de todos los metil esteres monoinsaturados tuvieron los picos M+, M+-31, M+-32, M+ -74 y el pico base fue de 55.

La estructura del compuesto 30 no pudo ser identificada, sin embargo, el espectro de masas presentó los fragmentos m/z 55, 69, 83, 97, 111, 236 y 270, indicando que se trata de un ácido graso. Para la determinación de la ubicación de los dobles enlaces de todos los compuestos monoinsaturados, el extracto fue sometido a una reacción de derivatización con DMDS, esta reacción representa un conveniente y efectivo método para la determinación de la posición de dobles enlaces en esteres monoinsaturados, sin embargo, esta metodología se dificulta en sistemas conjugados (Shibamoto et al., 2016).

Los bioensayos fueron realizados con hormigas de la especie Camponotus morosus y se observó la respuesta hacia distintas dosis de extractos que contenían los compuestos enlistados en la Tabla 1 y además frente a ejemplares vivos de larvas (Tabla 2).

La mayor colecta de insectos de P. recurva se consiguió entre los meses de eneromayo del año 2017, luego de los incendios forestales que ocurrieron en noviembre de 2016 en el sector de Los Pinos, Quilpué, Valparaíso. La gran presencia de ejemplares se debió a que los insectos detectan y se orientan hacia la fuente de humo y la respectiva emisión de volátiles que actúan como kairomonas (Álvarez et al., 2015).

La secreción larval de P. recurva contiene muchos compuestos que han sido reportados en especies hospederas y en insectos (Luís et al., 2016; Szczepanik, 2018; Mitra et al., 2017). Los compuestos mayoritarios encontrados correspondieron a ácidos grasos. En larvas de especies como hormigas, escarabajos y lepidópteros, se ha encontrado que estos provienen de aminoácidos (Tittiger y Blomquist, 2017).

La manera en que usualmente se realiza una identificación de la ruta biosintética es mediante marcaje isotópico de ácidos grasos que actúan como precursores, estos pueden ser agregados tópicamente al insecto para posteriormente proceder al análisis mediante GC-MS. Una aproximación a la comprensión de la biosíntesis es la identificación total de los ácidos grasos presentes en la secreción larval. El doble enlace en la posición Δ9 en los componentes identificados en insectos se introduce por lo general por la acción de una Δ9 desaturasa (Min et al., 2017) produciendose una mezcla isomérica. Las secreciones de la larva estudiada revelaron grandes cantidades de (Z)-9-hexadecenoato de metilo (8,8%), mientras que el isómero E se encontró solo en un 0,2%, esto sugiere que la acción la enzima desaturasa juega un rol importante en la formación isomérica de los compuestos encontrados. La presencia de los compuestos hexadecanoato de metilo, tetradecanoato de metilo y dodecanoato de metilo indicaría un acortamiento de cadena por la acción de una -oxidasa a partir del ácido octadecanoico, tal como se muestra en la Figura 2.

Aunque muchos precursores de los constituyentes de la secreción han sido reportados en la planta huésped, no podemos excluir la biosíntesis de estos por parte de las larvas.

En el caso del iridoide encontrado, no se ha reportado su biosíntesis en larvas de coleópteros, sin embargo, se conoce la ruta vía mevalonato mediante la hidrolisis de glicósidos presentes en plantas y su posterior acción enzimática (Abdallah y Quax, 2017). Por otra parte, la secreción de larvas no fue analizada cuantitativamente.

Los bioensayos con hormigas revelaron que la actividad repelente hacia la secreción larval es independiente si las hormigas son expuestas a ejemplares vivos de larvas o hacia el extracto de estas, muy pocas hormigas intentaron acercarse al lugar donde estaban los productos químicos. Ácidos grasos han sido reportados con actividad repelente hacia varios artrópodos y se ha propuesto su potencial uso como bioplaguicida (Reifenrath, 2015), en este sentido, los estímulos ensayados que contenían la secreción larval mostraron una potente repelencia, y por lo tanto parecen muy efectivos en defensa contra las hormigas de la especie C. morosus. Estos bioensayos proporcionan solo una información preliminar sobre la eficiencia defensiva real de las secreciones, pues no se analizaron los compuestos individuales, además no podemos descartar que la secreción contenga compuestos que ejerzan actividad repelente y no hayan sido detectados.

En campo se observó que la hormiga C. morosus no ataca en solitario a la larva de la especie P. recurva, sin embargo, si se alimenta de ejemplares ya muertos. Esta observación se correlaciona con la reportado para esta especie, en donde se señala que es una especie generalista y carroñera, que se alimenta con restos de insectos o insectos enteros muertos y solo un 0,65% se alimenta de larvas vivas de insectos del orden coleóptera (Grez et al., 1986).

4. Conclusiones

Se logró identificar 41 de los compuestos presentes en la larva de la especie P. Recurva, muchos de los cuales los obtiene directamente de la dieta o bien los produce degradando la biomasa del hospedero. Nuestros resultados muestran la evidencia empírica que la secreción de esta larva ejerce un efecto repelente contra hormigas de la especie C. morosus, en este sentido, la gran población de larvas puede ser sostenida en parte por su ventajoso sistema de defensa química.

Agradecimientos

Al apoyo financiero de la Vicerrectoría de Investigación y Postgrado de la Universidad Santo Tomás (proyecto código TAS 000022497). A Gaspar Reyes-Cordova por su apoyo en la colecta de insectos.

 

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Received January 25, 2019.

Accepted March 17, 2019.

 

* Corresponding author

E-mail: luisreyesga@santotomas.cl (L. Reyes-García).

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