Genetic diversity of antagonistic bacterial isolates obtained from Theobroma cacao L. to control Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 1

Diversidad genética de aislados bacterianos antagónicos obtenidos de Theobroma cacao L. para el control de Fusarium oxysporum f. sp. cubense raza 1

Hayron Fabricio Canchignia-Martínez1 ; Cristhian John Macías Holguín1, 2 *

Silvia Gicela Saucedo Aguiar1 ; Hugo Gabriel Ortiz Almea1 ; Leandro Cansing Arichabala2

Braulio José Lahuathe Mendoza2

1 Laboratorio de Microbiología Molecular del Departamento de Biotecnología, Carrera de Agronomía, Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales, Universidad Técnica Estatal de Quevedo, km 1.5 a Santo Domingo de los Tsáchilas, EC. 120501, Quevedo, Ecuador.

2 Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIAP), Mocache, Los Ríos, EC 170518, Ecuador.

* Corresponding author: cristhian.macias2016@uteq.edu.ec (C. J. Macías-Holguín).

Received: 20 March 2025. Accepted: 17 August 2025. Published: 1 September 2025.

Abstract

The banana (Musa AAA) is affected by Fusarium oxysporum f. sp. cubense, which causes discoloration in the xylem duct, leading to terminal wilting. The use of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) as a biological control produces different antagonistic compounds and inhibits the growth of various phytopathogens. The objective of the study was based on the molecular identification of rhizobacteria that produce phytohormones with biocontrol activity against Foc-R1. The presence of the 225 bp ChiA gene was observed in PGPR. Phylogenetic analysis of 16S rRNA by sequencing and ERIC-PCR showed genetic variability with the formation of four subgroups. Molecular identification by sequencing the 16S rRNA gene defined the genera as Klebsiella, Enterobacter, and Pseudomonas. There is variation in the biosynthesis of the phytohormones AIA, AG, and AS in strains MH-18, W-417, and FZ 9-7 at 72 h. The identification of Foc-R1 by PCR shows an amplicon of 350 bp. Antagonistic assays of bacterial supernatants from strain FZ 9-7 show 71% mycelial inhibition of Foc-R1 and a decrease in spore production of 2.5X106 spores mL-1. The results provide information on the genetic relationships of PGPRs through the production of secondary metabolites such as proteases, catalases, chitinases, and siderophores, as well as morphological and molecular analysis for the identification of Foc-R1 and its interaction with antagonistic extracts in inhibiting the growth of diseases in bananas and cocoa.

Keywords: Indole-3-acetic acid; gibberellic acid; salicylic acid; cell extracts; ChiA gene; Musa acuminata.

Resumen

El banano (Musa AAA) se ve afectado por Fusarium oxysporum f. sp. cubense, provoca decoloración en el conducto xilemático para causar un marchitamiento terminal. La utilización de rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPR) como control biológico producen diferentes compuestos antagonistas e inhiben el crecimiento de diversos fitopatógenos. El Objetivo del estudio se basó en la Identificación molecular de rizobacterias productoras de fitohormonas con actividad biocontroladora a Foc-R1. Se observó la presencia del gen ChiA de 225 pb en las PGPR. El análisis filogenético al ARNr 16s por secuenciación y ERIC-PCR mostró variabilidad genética con la formación de cuatro Sub-grupos. La identificación molecular por secuencia al gen ARNr 16S definió lo géneros a Klebsiella, Enterobacter y Pseudomonas. Existe variación en las biosíntesis de las fitohormonas AIA, AG y AS en las cepas MH-18, W-417 y FZ 9-7 a las 72 h. La identificación de Foc-R1 por PCR muestran un amplicón de 350 pb. Los ensayos antagonistas de los sobrenadantes bacterianos la cepa FZ 9-7 muestra inhibición micelial a Foc-R1 del 71% y disminuye la producción de esporas 2.5X106 esporas mL-1. Los resultados proporcionan información sobre las relaciones genéticas de las PGPR por la producción metabolitos secundarios como proteasas, catalasa, quitinasas y sideróforos, así como el análisis morfológico y molecular a la identificación Foc-R1 y su interacción con los extractos antagónicos al inhibir el crecimiento de enfermedades en banano y cacao.

Palabras clave: ácido indol-3-acético; ácido giberélico; ácido salicílico; extractos celulares; gen ChiA; Musa acuminata.

DOI: https://doi.org/10.17268/sci.agropecu.2025.047

Cite this article:

Canchignia-Martínez, H. F., Macías Holguín, C. J., Saucedo Aguilar, S. G., Ortiz Almea, H. G., Cansing Arichabala, L., & Lahuathe Mendoza, B. J. (2025). Diversidad genética de aislados bacterianos antagónicos obtenidos de Theobroma cacao L. para el control de Fusarium oxysporum f. sp. cubense raza 1. Scientia Agropecuaria, 16(4), 617-631.

1. Introducción

El banano (Musa spp.) en las últimas décadas está amenazado por F. oxysporum f. sp. cubense (Foc), conocido como mal de Panamá (Siamak & Zheng, 2018). Esta enfermedad que ocasionó grandes pér­didas al cultivar Gros Michel Musa acuminata (AAA) a fines del siglo XIX (Gurdaswani et al., 2020). Las esporas ingresan a la planta a través de sus raíces y desarrollan hifas largas septadas, que se extienden hasta el xilema y bloquean el suministro de agua alrededor de la planta y provoca el marchitamiento (Niwas et al., 2022).

Los síntomas internos incluyen decoloración de amarillo a marrón rojizo de los tejidos vasculares (Dita et al., 2010). Los síntomas externos por Fusarium comienzan con el amarillamiento y el marchitamiento de las hojas más viejas y progresan hacia las hojas más jóvenes hasta que la planta muere (Izquierdo-García et al., 2021). El patógeno se puede diseminar a través de estructuras propa­gativas como microconidios, macroconidios y cla­midosporas (Meldrum et al., 2013). Las clamidospo­ras tienen una pared celular engrosada que permane­cen inactivas en suelos infestados durante décadas y permite hacer frente a condiciones ambientales extremas (Were et al., 2023).

Se consideran fuentes de diseminación de Fusarium sp. al material de siembra, afluentes de agua, partí­culas del suelo, herramientas, calzado y maquinaria (Magdama et al., 2019a). Existen tres razas que afectan al banano como son: Foc raza 1, que causa enfermedades en el cultivar ‘Gros Michel’ (AAA), también ataca a las variedades ‘Lady Finger’ (AAB) y ‘Silk’ (AAB). La raza 2 afecta a los bananos de coc­ción como 'Bluggoe' (ABB) y la raza 4 es capaz de atacar a ‘Cavendish’ (AAA) así como a las otras va­riedades de banano afectadas por las razas 1 y 2 (Martín et al., 2021).

Las Rizobacterias Promotoras de Crecimiento Vegetal (por sus siglas en inglés, PGPR) que habitan en el suelo, donde su funcionalidad es colonizar las raíces para mejorar el incremento de biomasa vegetal, crecimiento del sistema radicular, floración, contenido de clorofila y nutrientes del tejido foliar y el peso de brotes por la producción de Ácido Indol-3-Acético (AIA), Ácido Giberélico (AG) y Ácido Salicílico (AS) (Keswani et al., 2022; Macías Holguín et al., 2023a; Prisa et al., 2023; Canchignia-Martínez et al., 2025a). El mecanismo de biocontrol de las PGPR implica la producción enzimas como la quitinasas y proteasa, que degradan la pared celu­lar fúngica a N-acetil D-glucosamina (Verma et al., 2023). Inducción de resistencia sistémica adquirida (SAR), inducción de resistencia sistémica (ISR) y producción de metabolitos antifúngicos como: Cianuro de Hidrógeno (HCN), Ácido Fenazina-1-Carboxílico (PCA), Pioluteorina (Plt), Pirrolnitrina (Prn) y 2,4-diacetilfloroglucinol (2,4 DAPG) que suprimen la germinación de conidias a enfermedades fitopató­genas (Crespo-Clas et al., 2024; Crespo Ávila et al., 2024; Canchignia-Martínez et al., 2025b).

Las herramientas moleculares, como la secuencia­ción, la reacción en cadena de la polimerasa, la ca­racterización molecular y la diversidad genética de las poblaciones de bacterianas son fundamentales para la identificación de especies y para compren­der la dinámica de la microbiota del suelo (Rouhrazi & Khodakaramian, 2015; Getahun et al., 2020). Un método conocido a la variabilidad genética del mi­crobioma es la técnica de PCR de consenso inter­génico repetitivo de enterobacterias (ERIC-PCR) es­pecífica que es confiable, reproducible, rápida y altamente discriminatoria para la diferenciación de especies y subespecies (Odori et al., 2020; Auhing Arcos et al., 2021). El fraccionamiento de los pro­ductos de la PCR produce un patrón de huellas dactilares complejo con el que se pueden diferen­ciar las cepas bacterianas (Singh, 2014). Las secuen­cias ERIC reconocen en una gran cantidad de ge­nomas bacterianos, incluidos miembros de la fami­lia Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Moraxellaceae etc (Chen et al., 2011). Esta diversi­dad evoca los procesos de evolución entre cepas bacterianas dentro de una especie (Ranjbar et al., 2017). El análisis de identificación molecular de bac­terias comienza por secuenciación del gen ARNr 16S. El gen codifica el componente de ARN de la subunidad 30S del ribosoma bacteriano que está presente en todas las bacterias se puede obtener información de distintos grupos filogenéticos, taxo­nómico e identificación a nivel de género y especie de las procariotas del 97% (Drancourt et al., 2000; da Silva et al., 2019; Satilmis et al., 2019).

El marchitamiento causado por F. oxysporum f. sp. cubense genera tres tipos de esporas, que incluyen: macroconidios, microconidios y clamidosporas siendo este último resistente a varios fungicidas sintéticos y generan un nuevo ciclo de in­fección. Al no existir un método de control químico eficaz para controlar la incidencia del mal de Panamá. Entre las alternativas se encuentra el uso de los agentes de control biológico de origen mi­crobiano las cuales poseen características benéficas como la producción enzimas hidrolíticas y metabo­litos antagónicos con distintos efectos antibacte­riano, nematicida y antifúngicos. Donde el objetivo de este estudio se basa en el análisis filogenético al gen ARNr 16S y ERIC-PCR e identificación del gen ChiA de las PGPR como potencial empleo a la biosíntesis de fitohormonas (AIA, AG y AS) y actividad antagonista en desarrollo micelial y generación de esporas de FOC-R1.

2. Metodología

La investigación se realizó en el laboratorio de Biotecnología Molecular, ubicados en el Campus Experimental “La María” propiedad de la Universidad Técnica Estatal de Quevedo (UTEQ), ubicada en el km 7,5 de la vía Quevedo- Mocache, provincia de Los Ríos, Ecuador. Ubicada a 01º 04’ 48.6” de latitud sur y 79º 30’04.2” de longitud oeste y, a una altitud de 85 msnm.

Caracterización por PCR al gen ChiA

A la identificación de gen ChiA se seleccionaron 10 rizobacterias PGPR que mostraron antagonismo hacia Phytophthora palmivora y Lasiodiplodia theobromae. Estas bacterias se encuentran crioconservadas en glicerol al 10% a -40 °C del banco de germoplasma del Laboratorio de Microbiología y Biología Molecular de la UTEQ (Tabla 1). El ADNg se obtuvo al emplear PureLink™ Genomic DNA Mini Kit - Thermo Fisher Scientific, según el protocolo descrito por el fabricante. Para la amplificación molecular se empleó los primers específicos chiAF (5'GATATCGACTGGGAGTTCCC3') y chiAR (5'CATAGAAGTCGTAGGTCATC3'), con pro-ducto de amplificación 225 pb (Ramaiah et al., 2000).

Tabla 1

Mecanismo de acción de las rizobacterias

Tejido: R-radicular y F-foliar. Mecanismo de acción. Solubilización: N- nitrógeno, P- fósforo, K- potasio, Antagonismos: PR-actividad proteolítica, FLT-fluorescencia, SFR- producción de sideróforo (Canchignia-Martínez et al., 2024c).

La PCR se la realizo en un volumen de 20 µL con: 2 µL Dream taq Green buffer (1X), 1 µL dNTPs, 1,5 µL/cada primer, 0,2 µL Dream taq DNA polimerasa, 2 µL ADN, 13,3 µL H2O. La reacción de PCR se desa­rrolló en el termociclador (TECHME®). Las condicio­nes de la reacción de PCR: a 94 °C por 4 min; 35 ciclos a 92 °C por 1 min; 58 °C por 1 min; 72 °C por 1 min, extensión final de 72 °C por 7 min. Los pro­ductos amplificados se verificaron por electroforesis en gel de agarosa al 1,5% teñidos en bromuro de etidio. Los fragmentos se determinaron por com­paración con el marcador de peso molecular 100 bp (Invitrogen®).

Identificación molecular por amplificación al ARNr 16S y generación de perfiles moleculares por ERIC-PCR

Se amplificó el gen para el ARN ribosomal 16S em­pleando partidores universales 8F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) y 1492R (5’-ACG GCTACCTTGTTACGACTT-3’) que amplifica una re­gión la subunidad ribosomal 16S de 1500 pb (Hernández-García et al., 2008). La PCR se realizó en un volumen de 20 µL con: 2 µL Dream Taq Green buffer (1X), 1 µL dNTPs, 1,5 µL/cada primer, 0,2 µL Dream taq DNA polimerasa, 2 µL ADN, 13,3 µL H2O. La reacción de PCR se desarrolló en el ter­mociclador (TECHME®) con las condiciones térmi­cas: 94 ºC por 4 min; 40 ciclos a 92 ºC por 30 s; 58 ºC por 60 s; 72 ºC por 60 s; extensión final de 72 ºC por 10 min. Los productos amplificados se verifica­ron por electroforesis en gel de agarosa al 1,5% teñidos en bromuro de etidio. Los fragmentos se determinaron por comparación con el marcador de peso molecular 100 bp (Invitrogen®). Los productos amplificados se purificaron empleando el kit Invitrogen PureLink™ (GERMANY), siguiendo el protocolo descrito por el fabricante. Los fragmen­tos de 1500 pb, al ARNr 16S se secuenció por MACROGEN empleando los partidores universales 518F (5´-CCAGCAGCCGCGGTAATAC-´3) y 800R (3´-TACCAGGGTATCTAATCC-´5). por (Macrogen, Seúl, Korea). Las secuencias se compararon con la base de datos de GenBank de NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), empleando Basic Local Alignment Search Tool (BLAST). El árbol filo­genético al gen ARNr 16s, se construyó empleando el método Maximun Likelihood y alineados con múltiples secuencias bacterianas disponible en NCBI. El porcentaje de la réplica del árbol se obtuvo con ‘bootstrap’ de valores de 1000 (Felsenstein, 1985). Se eligió el mejor modelo de acuerdo al cri­terio de información Bayesian (BIC), Kimura-2-parámetros con el programa MEGA 6.06 (Tamura et al., 2013).

El protocolo de ERIC-PCR se realizó a lo descrito por Louws et al. (1994) con algunas modificaciones. Con el empleo de los partidores ERIC-1R (5′ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′) y ERIC-2F (5′AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′). La PCR se realizó en un volumen de 20 µL con: 2 µL Dream taq Green buffer (1X), 1 µL dNTPs, 1,5 µL/cada pri­mer, 0,2 µL Dream taq DNA polimerasa, 2 µL ADN, 13,3 µL H2O. La reacción de PCR se desarrolló en el termociclador (TECHME®). Las condiciones de la reacción de PCR: 94 °C por 3 min; 40 ciclos a 94 oC por 1 min; 37 oC por 2 min; 72 oC por 2 min; exten­sión final de 72 oC por 10 min. Los productos am­plificados se verificaron por electroforesis en gel de agarosa al 1,5% teñidos en bromuro de etidio. Los fragmentos se determinaron por comparación con el marcador de peso molecular 100 bp (Invitrogen®). Los perfiles generados por ERIC-PCR, generó la información binaria de (0 y 1), reempla­zando por las letras (A y T). La historia evolutiva se infirió empleando el método Maximun Likelihood, el árbol filogenético se construyó empleando la distancia evolutiva de Tamura 3-parametro con el programa MEGA 6.06. El porcentaje de la réplica del árbol se obtuvo con ‘bootstrap’ de valores de 1000 (Felsenstein, 1985). Se eligió el mejor modelo de acuerdo al criterio de información Bayesian (BIC), Kimura-2-parámetros con el programa MEGA 6.06 (Tamura et al., 2013).

Producción de ácido indol-3-acético (AIA)

Para el análisis de síntesis de AIA las rizobacterias se inocularon en medio de cultivo líquido King B descrito por King et al. (1954), [(g L-1): peptona, 20,0 g; glicerol, 15 mL; K2HPO4, 1,5 g; MgSO4 x 7H2O, 1,5 g;)] suplementado con 5 mM de L-triptófano (Trp) (Thermo Fisher Scientific) se incubaron a 150 rpm por 24 y 72 h a 28 °C para su muestreo. Para la cuantificación a producción de AIA, del cultivo bacteriano se cosechó 750 μL de sobrenadante centrifugadas a 10000 rpm durante 5 minutos. Se añadió 250 μL de la solución de Salkowski (3:1) y mantuvieron en oscuridad por 30 min (Gang et al., 2019). El cambio de coloración de rojo a rojo intenso muestra rasgo positivo de producción de AIA. La cantidad AIA (µg mL-1) fue cuantificada mediante espectrofotómetro "UNICO" modelo 1205 a 530 nm (Gordon & Weber, 1951). Se estableció una curva estándar con una hormona AIA comercial (Sigma-Aldrich) a 5, 10 15, 20, 25 y 30 µg mL-1 (Saker & Al-Rashid, 2013).

Producción de ácido giberélico (AG)

Las rizobacterias se cultivaron en caldo nutritivo [(g L-1): peptona 5 g; cloruro de sodio 5 g, extracto de carne 1,5 g, extracto de levadura 1,5 g, pH 7,4] suplementado con 3 mM de L-metionina (Merck) incubadas a 150 rpm por 24 y 72 h a 28 °C para su muestreo (Jaroszuk-Ściseł et al., 2019). Para la producción de giberelina se empleó el método estándar de Holbrook et al. (1961). Del cultivo bacteriano, se recuperó 5 mL del sobrenadante acidificado pH 2 con HCl 1N centrifugado por 5 min a 8000 rpm. Se agregó 2 mL de Zn(C₄H₆O₄) y 2 mL C₆FeK₄N₆ e incubadas a 27 °C durante 75 minutos. La cuantificación de AG se determinó a 254 nm utilizando el espectrofotómetro UV-Vis Genesys™ 10S y comparadas con una curva estándar de calibración a concentraciones de 10, 20, 40, 60, 80 100 μg mL-1 de ácido giberélico (Sigma-Aldrich) (Kesaulya et al., 2015).

Producción de ácido salicílico (AS)

Las bacterias se cultivaron en medio de cultivo casaminoácidos tamponados con Tris-HCl [(g L-1: Tris-HCl, 12 g; MgSO4x7H2O, 0,25 g; de K2HPO4, 0,9 g; casaminoácidos, 5 g; pH 7,5)] suplementado con 0.1 mM de FeCl3 e incubadas a 150 rpm por 24 y 72 h a 28 °C para su muestreo Mishra & Baek (2021). Del cultivo de células se centrifugó a 10000 rpm durante 10 min y se recuperaron 2 mL de sobrenadante acidificado pH 2. Se agregó 2 mL CHCl3 para la extracción de ácido salicílico en relación (1:1). A los extractos de cloroformo se le añadió 4 mL de H2O y 5 mL de FeCl3 a 2M (Meyer & Abdallah, 1978a). Las soluciones ácido salicílico-hierro púrpura se determinaron por espectro-fotometría "UNICO" modelo 1205 a 527 nm y una curva estándar con ácido salicílico (Thermo Scientific Chemical) a 10, 20, 40, 60, 80 100 μg mL-1 (Cook, 1993).

Identificación de F. oxysporum f. sp. cubense raza 1

Se recolectaron muestras de tejido necrótico vascular de Gros Michel (AAA) mismas que se llevaron al Laboratorio de Microbiología de la UTEQ. Las muestras se desinfectaron de forma superficial con etanol al 70% durante 30 s, NaClO al 5% por 1 min, lavadas con H2O estéril y segmentada en 1 cm2. Se colocaron 5 segmento de tejido vascular en placa Petri con PDA que contenían 120 mg mL-1 de estreptomicina y 250 mg mL-1 de cloranfenicol e incubadas a 28 °C durante cinco días para la obtención de cultivo monospórico de hongo del agente causal (Magdama et al., 2020b). Se observó la morfología de la colonia por su pigmentación y textura. Los caracteres morfológicos se visualizaron por microscopía óptica (ocular 8X y objetivo 100X) como la forma de las esporas microconidios, macroconidios y clamidosporas de Fusarium spp. descrito por Mostert et al. (2017).

Para la extracción de ADNg se tomaron fragmentos de micelio mismo que fueron pulverizados en N2 líquido siguiendo el protocolo descripto por el fabricante DNeasy Plant Mini Kit de (QIAGEN-Start EE.UU.). La identificación de Foc-R1 se realizó por PCR, se empleó los oligonucleótidos específicos W1805F (5’-GTTGAGTCTCGATAAACAGCAAT-3’) y W1805R (5’-GACGAGGGGAGATATGGTC-3’) (Li et al., 2012). Para la PCR preparó un volumen de 20 µL con: 2 µL Dream taq Green buffer (1X), 1 µL dNTPs, 1,5 µL/cada primer, 0,2 µL Dream taq DNA polimerasa, 2 µL ADN, 13,3 µL H2O. La reacción de PCR se desarrolló en el termociclador (TECHME®). Las condiciones térmicas: 94 ºC por 1 min; 35 ciclos a 94 ºC de 1 min; 94 ºC por 30 s; 55 °C por 1 min, extensión final de 72 °C por 10 min. Los productos amplificados se verificaron por electroforesis en gel de agarosa al 1,5% teñidos en bromuro de etidio. Los fragmentos se determinaron por comparación con el marcador de peso molecular 100 bp (Invitrogen®).

Obtención de los extractos celulares antagónicos

La rizobacterias se incubaron en 50 mL de King B líquido a 150 rpm durante 28 °C por 72 h en un agitador. Se recuperaron 15 mL en tubos falcón del inóculo bacteriano centrifugado a 6000 rpm por 5 min, este proceso se realizó por triplicado para separar el sedimento bacteriano. Los extractos celulares se filtraron empleando Nalgene Syringe de 0,2 µm y sometidas a choque térmico de 15 min a 90 °C a baño María y 15 min a – 40 °C en el ultra congelador por triplicado y almacenados a 4 °C.

Inhibición de las estructuras miceliales y de prolife-ración de FOC-R1 por metabolitos antagonistas de PGPR

Se inocularon 0,2 mL de los extractos celulares y esparcidos en 11,8 mL de medio PDA y distribuidas en cajas Petri por triplicado. Se añadió un disco (Ø 7 mm) de micelio en el centro de la placa y se adicionó una placa control sin inoculación de sobrenadantes. Se evaluó el porcentaje de inhibición de los enfrentamientos sobrenadante-patógeno desde el extremo del tarugo hasta el crecimiento fúngico a los 5, 10, 15 y 20 después de la inoculación (dpi), utilizando la formula % inhibición = (crecimiento del control – crecimiento del tratamiento / crecimiento del control) x 100.

Para la generación de esporas se esparcieron 10 mL de agua destilada estéril en placas Petri para la suspensión de esporas y filtradas con papel filtro para la separación de fragmentos de micelio. Se recuperó 1,48 mL de suspensión mezclada con 20 µL de azul de tripán. Se colocó 10 µL de la solución para su visualización en cámara Neubauer, para el conteo en cinco de los cuadrantes de 0,20 mm2, para determinar la concentración de microconidios = (número de células x 10.000) / (número de cuadros).

En todos los experimentos los tratamientos contemplan 5 réplicas con 3 unidades experimen-tales cada una. Los valores a cada condición están representados con la desviación estándar promedio individual (±), los tratamientos fueron sujetos al análisis de varianza por ANOVA, y separados por procedimiento de comparación múltiple de Tukey SD, al nivel de significancia de (p ≤ 0,05), empleando el programa estadístico Statgraphics CenturionTM V.18 (Statgraphics Technologies, 2019).

3. Resultados y discusión

Caracterización molecular del gen chiA por PCR

Se determinó la presencia del gen chiA que codifica el dominio catalítico de las quitinasas bacterianas con un producto de amplificación de 225 pb en las rizobacterias (PV-25, AC-3, BF-567, MH-18, MN 5-19, MN 5-20, CH-1, FZ 9-7, W-417, LH 5-10) (Figura 1). Donde los agentes de biocontrol de P. protegens CHA0 y P. flourescens Pf5 han recibido especial atención debido a que sintetiza metabolitos de actividad antifúngica y antibacteriana como 2,4 DAPG, Prn, Plt y HCN de amplio espectro que influyen a la actividad antagonista a problemas fitosanitarios y estimula la resistencia sistémica inducida en plantas al interaccionar con las raíces de la planta (Maurhofer et al., 2004). Al efecto inhibitorio en crecimiento micelial de Sclerotinia sclerotiorum, Rhizoctonia solani y antibiosis a Rasltonia solanacearum se debe a la producción de 2,4 DAPG, Plt y Prn por P. protegens RS-9 (Rai et al., 2017).

Figura 1. Amplificación del gen ChiA de 225 pb por cepas bacterianas productoras de quitinasas. M, marcador de masa molecular (Lader 100 pb Invitrogen). Carriles 1-10 (PV-25, AC-3, BF-567, MH-18, MN 5-19, MN 5-20, CH-1, FZ 9-7, W-417, LH 5-10).

Relación filogenética de las rizobacterias

La caracterización molecular al gen ARNr 16S exhibe que la cepa PV-25 mantiene una homología del 100% a Klebsiella pneumoniae NF21. La bacteria MN 5-20 identidad con Enterobacter hormaechei del 100%. Las cepas AC-3 y MN 5-19 con alta identidad con Enterobacter cloacae del 100%. Tres bacterias BF-567, MH-18 y LH 5-10 poseen alta identidad con Pseudomonas putida del 91% y 100%. Las bacterias FZ 9-7 y W-417 muestra una alta identidad con Pseudomonas chlororaphis y Pseudo­monas simiae del 99% y 100%. La bacteria CH-1 posee una alta identidad con Klebsiella variicola del 100%. Los datos genotípicos presentados aquí dan como resultado sustancialmente la identificación y selección de nuevas rizobacterias PGPR (Tabla 2). El análisis filogenético por gen ARNr 16S generó dos grandes grupos. El Grupo I reúne los sub-grupo (A-B) de mayor homología cinco bacterias K. pneumoniae (PV-25), E. cloacae (AC-3), E. cloacae (MN 5-20), E. hormaechei (MN 5-20) y K. variicola (CH-1) y la formación del Grupo II reúne al sub-grupo (C-D) las bacterias P. putida (BF-567), P. putida (MH-18), P. putida (W-417), P. putida (LH 5-10) y P. chlororaphis (FZ 9-7) (Figura 3). Estas bac­terias guardan una estrecha relación filogenética del gen ChiA que codifica a la producción de la enzima quitinasas al biocontrol de enfermedades fitopatógenas (Oktavioni et al., 2020). La quitinasa provoca la lisis de la pared celular de los hongos patógenos, al realizar cambios en las formas morfológicas de los hongos (esporulación, germinación de esporas y crecimiento de hifas) y la inhibición en eclosión de huevos de Meloidogyne incognita (Lee & Kim, 2015; Asril & Supriyadi, 2024).

Estas se agrupan en dos familias, donde cinco ce­pas bacterianas pertenecen a la familia Pseudomona-daceae al género Pseudomonas (MH-18, BF-567, W-417, LH 5-10, FZ 9-7) (Figura 2) con una secuencia de similitud del 99% a 100% a P. putida KT 2440 de capacidad de tolerar estrés salino y proceso de biorremediación (Fan et al., 2024).

Figura 2. Árbol filogenético de las rizobacterias basados en la secuenciación del gen ARNr 16S. El árbol filogenético basado al método Maximun Likelihood, las distancias evolutivas se basaron a Kimura 2-parámetro. Distancias horizontales son proporcionales a las distancias filogenéticas están expresadas en sustituciones para un porcentaje de 1000 repeticiones.

Tabla 2

Caracterización molecular de las rizobacterias al compararse por GenBank de NCBI

La cepa FZ 9-7 destaca su agrupamiento con P. protegens CHA0 y Pf-5 por sus rasgos de biocontrol a agentes patogénicos por producir metabolitos antagónicos como 2,4-diacetilfloroglucinol, cianuro de hidrógeno (HCN) y lipopéptidos cíclicos (Ramette et al., 2001; Flury et al., 2017). Reportes de P. chlororaphis PCL 1606 presentan actividad insec­ticida y nematicida por la producción de com­puesto volátiles como pirrolnitrina (PRN), fenazina-1-carboxamida (PCN) y 2-hexil-5-propil resorcinol (HPR) (Peng et al., 2018; Arrebola et al., 2022). El segundo grupo lo conforman a la familia Enteroba­cteriaceae constituida por los géneros Klebsiella y Enterobacter donde el agrupamiento CH-1, PV-25, AC-3, MN 5-19 y MN 5-20 carentes a producir en­zimas como proteasa (Pr) y quitinasas (Qn) que inestabilizan el tejido celular al degradarlo. Repor­tes de K. variicola HUB-IV-005 tienen la habilidad de fijar nitrógeno atmosférico (Qin et al., 2022), resistencia a los antibióticos (El-Sapagh et al., 2023).

La amplificación de secuencias Repetitivas de Consenso Intergénico de Enterobacterias (ERIC-PCR) generó un perfil genético de una a siete ban­das que varían en tamaño desde 100 a 2500 pb que muestra polimorfismo en el patrón de bandas me­diante las diez rizobacterias (Figura 3).

Figura 3. Patrón de huella dactilar de ADN de las rizobacterias generado por ERIC-PCR. M, marcador de masa molecular (Lader 100 pb Invitrogen). Carriles 1-10 (PV-25, AC-3, BF-567, MH-18, MN 5-19, MN 5-20, CH-1, FZ 9-7, W-417, LH 5-10).

Los rasgos característicos de la secuencia repetitiva por ERIC-PCR (124-127 pb) tiene una secuencia pa­lindrómica central conservada que se amplifica por todo el ge­noma obteniendo patrones de bandas únicos que sirven como identificador, por lo tanto, estas partes conservadas se utilizan como objetivo en biología molecular para la discriminación de es­pecies bacte­rianas (Versalovic, 1994; Baldy-Chudzik & Stosik, 2005). Esta técnica es útil en la clasificación y diferenciación de cepas bacterianas Gram positivas y Gram negativas.

Para determinar las relaciones genéticas de las rizobacterias, se construyó el análisis filogenético basado en huellas dactilares de ERIC-PCR donde se generó dos grandes grupos con una similitud del 86% a 100%. El Grupo I reúne cinco bacterias como MN 5-19, MN 5-20, AC-3 PV-25, CH-1. La forma­ción del Grupo II lo conforma las cepas MH-18, FZ 9-7, BF- 567, W-417, LH 5-10 (Figura 4).

Figura 4. Árbol filogenético basado al método Maximun Likelihood de las rizobacterias antagónicas.

De manera similar, otros investigadores también han aplicado fingerprinting como ARDRA (Amplified Ribosomal DNA-Restriction Analysis), ERIC (Entero-bacterial Repetitive Intergenic Consensus) y REP (Repetitive Extragenic Palindromic) y BOX-PCR para estudiar la diversidad genética de bacte­rias diazo­tróficas y endofítas obtenidos de cultiva­res como arroz, maíz, cacao, banano, palma, etc. (Shrivastava, 2017; Chávez-Artega et al., 2018). Las huellas dactilares genómicas de BOX-PCR producen tres grupos principales con 62 perfiles genéticos distintos utilizando BOX-PCR, que reflejaban un alto grado de diversidad entre especies de Pseudomonas fluorescentes en la rizos­fera del banano (Naik et al., 2008).

Cuantificación de fitohormonas (AIA, AG y AS)

No se registró diferencia estadística a las 24 h en la síntesis de ácido indol acético (AIA) con adicción de 5 mM de L-Trp. Se observo mayor incremento de E. cloacae MN 5-19 (70,61 μg mL-1) y P. putida MH-18 (68,90 μg mL-1). La producción de AIA se man­tiene en aumento de P. putida MH-18 y P. simiae W-417 (95,96 y 62,25 μg mL-1) a las 72 h de mues­treo, existiendo la disminución en la biosíntesis de AIA en K. pneumoniae PV-25 (4,85 μg mL-1) (Figura 5A). Esto resultados se alinean con Peñafiel-Jaramillo et al. (2016) que registró mayor incre­mento de producción auxínica por Pseudomonas veronii R4 en adición de 5 mM y 10 mM L-Trp a un intervalo de 72 h. A diferencia de Pseudomonas protegens CHA0 disminuye su biosíntesis. Estos re­sultados coinciden con Parvin et al. (2020) incre­menta los niveles de producción en AIA de 30 a 50 μg mL-1 con 0,8 mM de Trp evaluados por 72 y 120 h en Pseudomonas aeruginosa UPMP3 y Pseudo­monas putida UB1 (Bharucha et al., 2013). Donde al aumentar el Trp a 10 mM no genera incremento de síntesis de AIA por Pseudomonas sp. a 72 h de mestreo (Kalimuthu et al., 2019). Se ha demostrado que grupos bacterianos tanto rizosférico como filosférico son capaces de sintetizar AIA cuando el medio de cultivo es suplementado con 5 mM trip­tófano (L-Trp) como precursor para su biosíntesis (Figura 5B). Se han descrito al menos cinco rutas metabólicas como triptamina (TAM), indol-3-acecetonitrilo (IAN), triptofol, ácido indol-3-pirúvico (IPyA), indol-3-acetamida (IAM) diferentes para la síntesis de AIA similares a las de las plantas (Patten & Glick, 1996a; Patten et al., 2013c). Dos vías comunes de biosíntesis de AIA de las comunidades bacterianas La vía del indol-3-piruvato (IPyA) puede ser realizada por plantas y rizobacterias (PGPR) (Vega-Celedón et al., 2016). La enzima indolpiru­vato descarboxilasa es clave en la vía del ácido indol pirúvico (IPyA) (Patten & Glick, 2002b). La vía del indol-3-acetamida (IAM) solo puede ser utilizada por bacterias fitopatógenas como es el caso de Pseudomonas syringae subsp. savastanoi que au­mentó niveles severos de síntesis de AIA donde existe sobreexpresión (Kochar et al., 2011).

En la biosíntesis de ácido giberélico se observaron diferencia significativa con variabilidad en la pro­ducción de ácido giberélico (AG) añadido con 3 mM L-metionina, a 24 h de muestreo se presenta biosíntesis significativa para LH 5-10 y FZ 9-7 (22,92 y 20,87 μg mL-1). La cantidad de AG es liberada a las 48 h de muestro con aumento a su biosíntesis por P. chlororaphis FZ 9-7, P. putida LH 5-10 y K. variicola CH-1 (31,04 a 25,42 μg mL-1). La bacteria P. putida AC-3 expreso niveles bajo de AG (12,05 μg mL-1) (Figura 5C). La búsqueda de nuevas bacterias capa­ces de sintetizar ácido giberélico comienza estudios in vitro donde Beale et al. (1982) observó que Fusa­rium fujikuroi posee la capacidad de inducir varios compuestos bioactivos de giberelinas por su aso­ciación en el alargamiento de tejidos jóvenes en plantas vinculados en los procesos de división y elongación celular. El hongo Trichoderma DE­MTkZ3A0 es capaz de sintetizar AG suple-mentado con 3 mM L-Metionina y L-Triptófano a 120 h (Jaroszuk-Ściseł et al., 2019). En Bacillus sp. (HB32) no incrementa la síntesis de AG a 168 h (Kesaulya et al., 2015). Al reducir los niveles de L-metionina se observa aumento de síntesis de AG en Pseudomo­nas koreensis (MU2) a 120 h respec-tivamente (Kang et al., 2019). La capacidad de cada bacteria para producir ácido giberélico está influen-ciada por va­rios características bioquímicas como, temperatura, nutrientes en los medios de cultivo, humedad, pH y tiempo de incubación (Figura 5D). Los niveles de esta fitohormona en los tejidos vegetales podrían ser modulados por reguladores microbianos a tra­vés de mecanismos que imitan los modos de apli­cación exógenas, mitigación de estrés por sequía y metales pesados en los procesos fisiológicos y bio­químicos de las plantas (Gusmiaty et al., 2019).

En el análisis comparativo a la producción de ácido salicílico (AS) suplementado con 0,1 mM de FeCl3 presentaron diferencia significativa, con variabilidad en la producción de AS a su tiempo de muestro. A 24 h de muestreo, presenta una producción consi­derable de AS en P. putida LH 5-10 (18,63 μg mL-1) y E. cloacae AC-3 (14,65 μg mL-1). A 72 h de mues­treo su biosíntesis de AS va en aumento por P. chlororaphis FZ 9-7 (18,02 μg mL-1). Se reduce los niveles de producción de AS de 24 y 72 de mues­treo por CH-1 (2,70 a 2,29 μg mL-1) (Figura 5E). En condición limitante de 0,01 mM FeCl3, P. fluorescens CHA401 sintetiza ácido salicílico asociado principal­mente a sideróforos en forma de pioquelina, pioverdina, pseudobactin y derivados de salicilato durante el crecimiento limitado por hierro (Visca et al., 1993). La producción in vitro de AS por Pseudo­monas aeruginosa KMPCH, presentó los niveles de producción más alto este comportamiento está li­gado al tipo de sideróforos que produce (Hernández et al., 2004). Existe variación a la pro­ducción de sideróforos salicilato o ácido salicílico en dependencia al medio de cultivo por Azospirillum lipoferum CRAS-2 s a su tiempo de muestreo (Lenin & Jayanthi, 2012). En condiciones limitante hierro, P. fluorescens CHA0 incrementan la síntesis de ácido salicílico en forma de pioverdina que cumple una función siderófora. Al incorporar 5 μM inhibe el cre­cimiento celular de CHA0 (Meyer et al., 1992b). Las bacterias al incorporar condiciones limitantes FeCl3 (0,1 mM) producen aumento en la biosíntesis de ácido salicílico o salicilatos, exhibe actividad siderófora vinculada al desarrollo de Resistencia sis­témica adquirida (RSA) (Figura 5F). Esta producción bacteriana de salicilato a menudo está relacionada a la biosíntesis de pequeñas moléculas quelantes de iones férricos, sideróforos derivados del salicilo (co­nocidos como catecolato) en condiciones limitadas de hierro (Mishra et al., 2017).

Figura 5. Cuantificación de biosíntesis de fitohormonas de las rizobacterias. A. Producción de ácido indol-3-acético (AIA). B. Cambio de coloración de rojo a rojo intenso. C. Producción de ácido giberélico (AG). D. Cambio de coloración a naranja. E. Producción de ácido salicílico (AS). F. Cambio de coloración a purpura. Las barras indican el DE individual para tratamiento (±). Medias con letras iguales en la columna no difieren significativamente según Tukey (p ≤ 0,05).

Identificación de F. oxysporum f. sp. cubense raza 1

Del tejido vascular con síntomas de marchitamiento de la enfermedad se recuperaron fragmentos de micelio de F. oxyporum (Figura 6A). Una de las en­fermedades limitantes del marchitamiento de plan­taciones de Musa Acuminata es el mal de Panamá, ocasionado por F. oxysporum f. sp. cubense es el agente causal (López-Zapata & Castaño-Zapata, 2019). La identificado por PCR con el producto de amplificación de 350 pb. La especificidad de la reacción fue determinada al no observar amplifica­ción inespecífica en el control con M. fijiensis (Figura 6B). Los estudios realizados por Li et al. (2012) muestran un amplicón de 355 pb para F. oxysporum f. sp. cubense raza 1 al realizar la reacción de PCR, con los partidores (Foc_1F/2R; FocTR_F/R; W2987_F/R) se generó los productos de amplificación de 240 a 460 pb para Foc-4 y FocRT-4 (Magdama et al., 2020b). Las características mor­fológicas presentaron un micelio algodonoso septado con pigmentación blanca a violeta, formas de microconidios ovaladas, macroconidios casi rectos, delgados y de paredes delgadas con tres o cuatro tabiques, una célula basal en forma de pie y una célula apical cónica curva y clamidosporas son globosas de paredes gruesas (Figura 6 C-D).

Según Djeugap et al. (2023) muestra que F. oxyspo­rum f. sp. cubense de la localidad de Foumbot pre­senta una coloración rosado y parduzco, de forma algodonoso y plano expuesto a 25 °C esto se ve influenciado a las características morfológica, varia­bilidad genética, el fenotipo y ciclo de infección del hongo que provoca cambio de coloración en plantaciones de banano Gros Michel (Aguilar-Hawod et al., 2020; Thangavelu et al., 2021).

Actividad antagónica del enfrentamiento extractos celulares-patógeno sobre el crecimiento micelial y número de esporas

Se observa diferencia significativa sobre la efectivi­dad de los extractos celulares al inhibir el desarrollo micelial y generación de esporas de Foc-R1 a los 20 d.i.p. P. chlororaphis FZ 9-7, P. putida W-417 y E. cloacae AC-3 exhibieron el mayor porcentaje de in­hibición micelial entre (71% a 61%), a diferencia del control con crecimiento micelial normal.

El extracto celular de P. chlororaphis FZ 9-7 reduce generación de esporas a 2,55X106 esporas mL-1, a diferencia del hongo no tratadas genera con 3,40x107 esporas mL-1 (Control) (Figura 7A). Esto se atribuye a la actividad enzimática hidrolítica como son producción de celulosa (Cel), proteasa (Pr) y quitinasas (Qn) al entrar en contacto degra­dan de la pared celular de algunas clases de hongo como Oomycetos, ascomicetos y basidiomicetos (Figura 7B). Los resultados de los extractos celulares obtenidos de P. veronni R4, P. protegens CHA0 y S. marcescens PM 3-8 reducen el desarrollo micelial del 80% a P. palmivora producen compuestos vo­látiles de (HCN; PR) y antifúngico como (2,4 DAPG; Prn) (Cedeño Moreira et al., 2020), donde el meca­nismo de acción del cianuro de hidrogeno actúa en la inhibición de la respiración mitocondrial y fosfo­rilación oxidativa (Gupta et al., 2010, Rijavec & Lapanje, 2016).

El 2,4-Diacetilfloroglucinol genera compuestos antifúngicos que causan desacopla­miento de la respiración y la síntesis de ATP en las células fúngicas al alterar la integridad de la mem­bran y varias metaloenzimas capaz de ser un agente de control biológico (Suresh et al., 2021).

Figura 6. Identificación de Fusarium oxysporum f. sp. cubense raza 1. A. Síntoma asociado con el marchitamiento del banano Gros Michel (AAA) por Fusarium. B. Marcador de peso molecular M (Lader 100 pb Invitrogen); amplificación de FOC-R1 en carriles 1, 2 y 3; C, M. fijiensis. C. Micelio algodonoso con formación blanca de pigmento violeta en la colonia. D. Estructuras morfológicas.

Figura 7. Ensayo antagónico de los extractos celulares PGPR a FOC-R1. A. inhibición al desarrollo micelial y números de esporas a los 20 dpi. B El rendimiento de actividad antifúngica producidas por los extractos celulares que impiden el desarrollo del crecimiento micelial. Las barras indican el DE individual para tratamiento (±). Medias con letras iguales en la columna no difieren significativamente según Tukey (p ≤ 0,05).

Lo anterior se corrobora en el estudio de Guato-Molina et al. (2019) donde los metabolitos PR, HCN, Prn y 2,4-DAPG presentes en B. subtilis ATCC 55405, P. protegens CHA0, K. variicola BO 3-4 reduce significativamente al crecimiento micelial de F. oxysporum f. sp. Lycopersici, M. roreri y M. fijiensis e interrumpe el desarrollo de tubo germinativo de las esporas pre­sentando anomalías en los caracteres morfológicos en presencia de extractos celular de E. asburiae PM 3-14 que contiene un amplia gama de metabolitos antagónicos (Chávez Arteaga et al., 2020; Macías Holguín et al., 2023).

4. Conclusiones

Las bacterias provenientes de suelo rizosférico muestra mayor diversidad sobre la capacidad de biosíntesis de ácido indol acético, ácido giberélico y ácido salicílico hasta las 72 h de muestreo. Estas bacterias presentaron actividad quiniolítica al gen ChiA. La secuenciación al gen ARNr 16S presenta niveles de similitud del 91% a 100% para las bacterias de K. pneumoniae (PV-25), P. chlororaphis (FZ 9-7), K. variicola (CH-1) E. hormaechei (MN 5-20), E. cloacae (AC-3; MN 5-19), P. simiae (W-417), P. putida (BF-567; MH-18; LH 5-10). El proceso de inhibición antagónico de micelio a FOC-R1 in­ vitro por FZ 9-7 alcanzaron los promedios superiores al 70% y disminuye la generación de esporas destacándose la actividad antifúngica.

Las musáceas se encuentran amenazadas por enfer-medades vasculares como Fusarium oxysporum f. sp. cubense raza 4 tropical (FOC R4T) y Ralstonia solanacearum raza 2 que afectan a cultivares comerciales de banano (Musa acuminata AAA) y plátano (Musa balbisiana AAB) agentes capaces de provocar pérdidas devastadoras en la producción en su totalidad. En el Ecuador aún no se ha reportado la presencia de FOC R4T, la amenaza latente exige medidas de bioseguridad y desarrollo de estrategias agrobiotecnológicas para el manejo de enfermedades. El uso de FOC-R1 como modelo experimental se presenta como una herramienta estratégica para evaluar interacciones con sobrenadantes antagónicos por constituir un insumo valioso para la formulación de bio-inoculantes con aplicaciones en condiciones de invernadero y sistemas abiertos.

Las interacciones planta-patógeno-microbioma en el Ecuador siguen siendo una incógnita sobre su funcionalidad y mecanismos de defensa molecular que genera al entrar en contacto con enfer-medades vasculares. Como línea de investigación se propone la validación de consorcios microbianos en cultivares de Musa acuminata AAA evaluando su eficacia en la supresión de FOC-R1 en plántulas de cv Gros Michel y extendiendo su aplicación hacia otros fitopatógenos de relevancia como Ralstonia solanacearum raza 2 en plántulas de cv Williams y adicionar un análisis metagenómica y transcrip-tómica para estudiar los mecanismos moleculares involucrados en la inducción de resistencia sisté-mica y la producción de metabolitos antifúngicos y antibacterianos.

ORCID

H. F. Canchignia-Martínez  http://orcid.org/0000-0003-1195-5446

C. J. Macías Holguín  https://orcid.org/0000-0003-2068-8503

S. G. Saucedo Aguiar  https://orcid.org/0000-0002-8707-2175

H. G. Ortiz Almea  https://orcid.org/0009-0005-4484-7128

L. Cansing Arichabala  https://orcid.org/0009-0002-1944-9353

B. J. Lahuathe Mendoza  https://orcid.org/0000-0001-7985-1999

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