Caracterización morfológica, cultural y distribución de hongos asociados a granos de cacao

Morphological and cultural characterization and distribution of fungi associated with cocoa beans

Bryan Delgado-Ruiz1; Rachel Carranza-Chávez1; Diana Cedeño-Alcívar1 *

1 Escuela Superior Politécnica Agropecuaria de Manabí Manuel Félix López, Carrera de Agroindustria. Calceta, Ecuador.

ORCID de los autores:

B. Delgado-Ruiz: https://orcid.org/0009-0003-2545-6020 R. Carranza-Chávez: https://orcid.org/0009-0001-1119-407X

D. Cedeño-Alcívar: https://orcid.org/0000-0001-8420-7014

RESUMEN

El cacao ecuatoriano constituye un pilar de la economía nacional, aunque su calidad puede verse comprometida por la presencia de hongos productores de micotoxinas durante la fermentación y almacenamiento. El objetivo principal de este estudio fue identificar las cepas fúngicas presentes en granos de cacao fermentados mediante marcadores morfológicos, en cuatro centros de acopio del cantón Bolívar. Se recolectaron 150 granos por centro en la última fase de fermentación, los cuales fueron sembrados en medio DG18 e incubados a 25 °C. Las colonias desarrolladas fueron evaluadas mediante observaciones macroscópicas y microscópicas, apoyadas en claves taxonómicas. Se aislaron y caracterizaron 64 cepas fúngicas con amplia variabilidad en textura, coloración y exudado. El análisis microscópico permitió identificar dos géneros predominantes: Aspergillus spp. y Penicillium spp., siendo Aspergillus el más abundante en todos los centros de acopio. El análisis estadístico evidenció diferencias significativas en la carga fúngica entre centros (p < 0.05), lo que refleja la influencia de las prácticas de fermentación y almacenamiento en la diversidad microbiana. En definitiva, la identificación de estos géneros destaca la necesidad de implementar controles rigurosos en el manejo postcosecha, dado que especies de la sección Aspergillus Nigri pueden producir ocratoxina A, comprometiendo la inocuidad del cacao.

Palabras clave: Cacao ecuatoriano; Ocratoxina A; Aspergillus; Fermentación; Caracterización morfológica; Caracterización cultural.

ABSTRACT

Ecuadorian cocoa is a pillar of the national economy, although its quality can be compromised by the presence of mycotoxin-producing fungi during fermentation and storage. The main objective of this study was to identify the fungal strains present in fermented cocoa beans using morphological markers in four collection centers in the Bolívar canton. One hundred and fifty beans per center were collected in the last phase of fermentation, which were seeded in DG18 medium and incubated at 25°C. The developed colonies were evaluated by macroscopic and microscopic observations, supported by taxonomic keys. Sixty-four fungal strains with wide variability in texture, coloration, and exudate were isolated and characterized. Microscopic analysis identified two predominant genera: Aspergillus spp. and Penicillium spp., with Aspergillus being the most abundant in all collection centers. Statistical analysis showed significant differences in fungal load between centers (p < 0.05), reflecting the influence of fermentation and storage practices on microbial diversity. Ultimately, the identification of these genera highlights the need to implement rigorous controls in post-harvest management, given that species of the Aspergillus Nigri section can produce ochratoxin A, compromising the safety of cocoa.

Keywords: Ecuadorian cocoa; Ochratoxin A; Aspergillus; Fermentation; Morphological characterization; Cultural characterization.

1. Introducción

El cacao no solo es un símbolo de prestigio que distingue a Ecuador a nivel mundial, sino que también ocupa un lugar destacado en su economía (Matute, 2021). El país se caracteriza por producir cacao fino de aroma, con una producción anual que oscila entre 60 y 70 mil toneladas (Solorzano et al., 2021). En 2023 Ecuador exportó cacao en grano por un valor de USD 1.171 millones, posicionándose como el cuarto producto de exportación no petrolero, solo superado por el camarón, el banano y el atún. Según la Revista Gestión Digital (2024) la disminución en la producción en países clave como Costa de Marfil y Ghana ha generado oportunidades para que el cacao ecuatoriano cubra parte de la demanda insatisfecha en los mercados internacionales, donde los precios sobrepasan los $10,000 por tonelada.

Los cantones Bolívar, Chone, Portoviejo, Junín y Tosagua, todos pertenecientes a la provincia de Manabí, aportan un total de 2,115 hectáreas a la producción de cacao. La Corporación Fortaleza del Valle, situada en Calceta (cantón Bolívar), recolecta aproximadamente 600 toneladas anuales con la participación de cerca de 961 productores distribuidos en los cantones mencionados. Esta producción se somete a múltiples procesos en los centros de acopio, que incluyen la recepción del cacao en baba, fermentación, secado, preselección del grano seco y almacenamiento (Cedeño et al., 2023).

La fermentación constituye una etapa esencial en el procesamiento del cacao, ya que en ella se generan los precursores del aroma y sabor característicos del chocolate. Esta fase está influenciada por el tipo de cacao, el tiempo de almacenamiento del fruto, el método y tipo de fermentación, la duración del proceso y la frecuencia de remoción. Ghisolfi et al. (2023) señalan que la fermentación de los granos de cacao involucra principalmente tres grupos microbianos: levaduras, bacterias del ácido láctico (BAL) y bacterias del ácido acético (AAB).

Estos microorganismos actúan en conjunto para asegurar una fermentación adecuada de los granos de cacao. Sin embargo, Cedeño y Vera (2019) advierten que en la etapa final de la fermentación pueden proliferar hongos filamentosos que generan ocratoxina A (OTA) una micotoxina altamente toxica con efectos neurotóxicos, inmunosupresores, genotóxicos, carcinogénicos y teratogénicos (Elías et al,.2021). La producción de OTA se atribuye principalmente a los hongos filamentosos de los géneros Aspergillus y Penicillium (Contreras et al.,2023).

En los granos de cacao, los principales hongos responsables de la producción de ocratoxina A pertenecen a los géneros Aspergillus niger y Aspergillus carbonarius, que son las especies predominantes en la contaminación durante la fermentación y el almacenamiento, especialmente bajo condiciones de alta humedad y temperatura (Ariza, 2021). Baca (2022), señala que la proliferación de estos hongos representa un obstáculo significativo para el comercio internacional del cacao. Además, plantea un riesgo para el mercado local, que frecuentemente absorbe productos de menor calidad, generando impactos negativos tanto en la economía como en la seguridad alimentaria debido a los riesgos toxicológicos asociados. Según Matute (2021), actualmente se implementan procesos de aislamiento y caracterización de cepas fúngicas para evaluar su impacto en la fermentación y en la calidad del producto final.

En Ecuador, la producción de cacao es una de las principales actividades productivas que contribuyen significativamente a la economía, no obstante, según diversos estudios han reportado una alta incidencia de Ocratoxina A (OTA) en chocolates artesanales, atribuida a prácticas deficientes de manejo postcosecha (Subroto et al., 2023). En el cantón Bolívar, algunos centros de acopio carecen de estudios que determinen la presencia de esta micotoxina o que establezcan una línea base de la microbiota patógena presente, lo que genera problemas tanto en la exportación como en el mercado interno, donde se comercializan productos de calidad inferior.

En este contexto, el objetivo del presente estudio es identificar las cepas fúngicas de granos de cacao fermentados, mediante marcadores morfológicos, en los centros de acopio del cantón Bolívar, con el fin de contribuir al conocimiento científico sobre el microbiota fúngico del cacao.

2. Metodología

Muestreo

Se seleccionaron cuatro empresas dedicadas al acopio de cacao, ubicadas en el cantón Bolívar, provincia de Manabí, Ecuador. Los centros de acopio participantes fueron: Kaakao S.A. (coordenadas 0°49.6057'S, 80°11.2376'W), Fortaleza del Valle (0°50.0561'S, 80°9.3211'W), Aroma de Montaña (0°49.5782'S, 79°52.9932'W) y Piedra de Plata (0°50.9450'S, 79°56.0429'W).

Se recolectaron 150 granos de cacao en cada uno de los cuatro centros de acopio del cantón Bolívar durante la última fase del proceso de fermentación, realizada en cajones de madera. Las muestras se obtuvieron de manera uniforme en los cuatro centros de acopio donde los granos de cacao recolectados fueron almacenados en bolsas plásticas herméticas y trasladados al laboratorio de Biología Molecular de la ESPAM MFL para su posterior aislamiento e identificación.

Aislamiento de diferentes géneros fúngicos

Para aislar e identificar hongos filamentosos se empleó el método de siembra directa en Agar Glicerol Dicloran al 18% (DG18), metodología propuesta por Pitt & Hocking (2009). Se seleccio-naron aleatoriamente 150 granos de cacao, los cuales fueron distribuidos en 30 placas de Petri (5 granos por placa) que contenían el medio DG18. Las placas incubadas a una temperatura de 25 °C durante un periodo de 5 a 7 días. Las colonias desarrolladas se evaluaron mediante observación macroscópica y microscópica para su posterior identificación morfológica.

Identificación morfológica de los diferentes géneros fúngicos

La identificación morfológica de los aislados fúngicos se realizó mediante siembra en medios específicos, observaciones macroscópicas y microscópicas, y el uso de claves taxonómicas descritas anteriormente por Pitt & Hocking (2009). Las colonias fúngicas obtenidas de cada muestra fueron contabilizadas y agrupadas según sus características morfológicas, con el fin de determinar la abundancia relativa (%) de cada género identificable, así como la densidad relativa (DR%), calculada según el método por González et al. (1996).

Las cepas pertenecientes a la sección Nigri del género Aspergillus fueron clasificadas en tres grupos, de acuerdo con la morfología de sus esporas y cabezas conidiales: aquellas con cabezas conidiales uniseriadas, como Aspergillus uniseriatus, y aquellas con cabezas biseriadas, entre las que se incluyen A. niger y A. carbonarius, conforme a lo señalado por Prendes (2016).

3. Resultados y discusión

La fermentación del cacao se caracteriza por una compleja sucesión microbiana que influye directamente en el desarrollo del sabor y aroma del producto final. Esta dinámica, en la que intervienen levaduras, bacterias y hongos, resulta esencial para transformar los granos, eliminar el mucílago y activar enzimas que potencian sus características organolépticas (Laranjo, 2021).

Análisis macroscópico de cepas fúngicas

Se aislaron y caracterizaron un total de 64 cepas fúngicas provenientes de los cuatro centros de acopio, evidenciando variabilidad en la textura, coloración y presencia de exudado. En el centro Piedra de Plata, se aislaron 18 cepas. Se observó una predominancia de colonias con superficie lisa y aterciopelada (12 de 18 cepas) muchas de las cuales presentaban exudado central (Figura 2). El color del micelio y del anverso mostró una amplia diversidad, destacándose tonalidades amarillas, verdes y marrones. Las cepas M18 Café y M1 Verde oliva registraron el mayor número de cepas aisladas.

En el centro Aroma de Montaña, las cepas fúngicas evaluadas presentaron una amplia diversidad morfológica, aunque la mayoría presentó una textura densa, aterciopelada y flocosa, se observó una notable variabilidad en la coloración del micelio y del anverso (Figura 3). Predominaron los micelios en tonos verdes y amarillos, mientras que el anverso mostró combinaciones de colores, como verde, blanco y amarillo. La presencia de exudado varió entre las cepas: algunas presentaron secreciones abundantes, concentradas en el centro de la colonia, como ocurrió con las cepas L1 M5 Verde oliva y L2 M20 Café. La cepa L1 M11 Amarillo registró el mayor número de colonias aisladas (30), caracterizándose por un micelio verde y un anverso verde amarillento, sin exudado detectable.

En el centro KAACAO se identificaron cinco cepas fúngicas que presentaron uniformidad en sus características de textura (Figura 4). Todas exhibieron una superficie densa y aterciopelada, lo que sugiere una consistencia similar en el patrón de crecimiento. En cuanto a la coloración, predominaron los micelios en tonos blanco y amarillo, mientras que el anverso mostró ligeras variaciones con combinaciones de blanco, amarillo y tonalidades intermedias.

Los resultados sobre la diversidad fúngica en los centros de acopio del cantón Bolívar se alinean con investigaciones previas realizadas en Ecuador. El estudio de Álvarez-Romero et al. (2025), enfocado en variedades tradicionales de cacao como CCN 51, Súper Árbol y Nacional, reportó una diversidad fúngica significativa, con alta abundancia de géneros como Penicillium, Epicoccum, Lasiodiplodia, Trichoderma y Fusarium. De manera particular, la investigación desarrollada en La Joya de los Sachas evidenció una notable riqueza de hongos endófitos, identificando hasta 14 géneros distintos. Por su parte, Tigrero-Vaca et al. (2022) describieron una sucesión microbiana en variedades Nacional × Trinitario, compuesta por levaduras, bacterias ácido-lácticas y acéticas, así como especies del género Bacillus. Por lo que, los perfiles fúngicos en el cacao pueden variar considerablemente dependiendo de la variedad y la región, reforzando la importancia de investigar los puntos de control a nivel local.

La elevada cantidad de hongos encontrada podría estar directamente relacionado con prácticas subóptimas durante la fermentación o el almacenamiento del cacao. Esta hipótesis coincide con estudios realizados en Colombia, donde Delgado-Ospina et al. (2022) reportaron recuentos de mohos superiores a 4 log UFC/g en muestras con procesos de fermentación prolongados (6 - 7 días). La duración inadecuada y el manejo deficiente del proceso fermentativo, así como la inclusión de granos dañados, pueden explicar los altos recuentos observados. Esto subraya la necesidad de un control riguroso de cada etapa, desde la selección de los granos hasta su almacenamiento, para mitigar el riesgo de proliferación fúngica.

Más allá de la frecuencia, la presencia predo-minante de Aspergillus spp. en los aislamientos que constituyen un resultado crítico para la seguridad alimentaria. Se ha documentado que cepas pertenecientes a la sección Aspergillus Nigri tienen el potencial de producir ocratoxina A (OTA), una micotoxina de gran relevancia. Delgado-Ospina et al. (2022) observaron que el cacao puede estimular la producción de OTA en Aspergillus Nigri, con niveles que varían significativamente. Si bien los hongos cumplen un papel multifacético en el cacao, y algunos pueden ser beneficiosos, la creciente preocupación por las micotoxinas, intensificada por factores como el cambio climático, hace indispensable el monitoreo y control. En esta misma línea, Konan et al. (2024) en Costa de Marfil, subraya que el riesgo no es local, sino que es una preocupación global en la cadena de producción del cacao.

En respuesta a la amenaza que representan las micotoxinas, diversos estudios han explorado métodos para controlar el crecimiento fúngico durante la fermentación. La adición de cultivos iniciadores, como Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum y Saccharomyces cerevisiae, ha demostrado ser una estrategia eficaz para suprimir el crecimiento de mohos (Marwati et al., 2021; Rahayu et al., 2021). De manera similar, Cedeño Alcívar et al. (2023) en un estudio en Manabí, lograron inhibir significativamente el crecimiento de Aspergillus spp. y Penicillium spp. con cepas de Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis. A su vez, Kadjo et al. (2023) evidenciaron que Bacillus thuringiensis ATCC 10792 puede suprimir el crecimiento fúngico. En conjunto, estos hallazgos respaldan el potencial del control biológico como alternativa viable para la reducción de contaminantes micotoxigénicos en la cadena de producción del cacao.

Otros factores, como la densidad de la masa fermentativa (Guzmán-Armenteros et al., 2023) y uso de método de fermentación en cajas (Ghisolfi et al., 2023) también han demostrado su eficacia en la reducción del crecimiento fúngico. Estos resultados confirman que la optimización de las condiciones de constituye un aspecto clave para fortalecer la seguridad microbiológica. En este sentido, la identificación de puntos críticos de control a lo largo de la cadena de producción, tal como se evidenció en el presente estudio, representa un paso esencial para la implementación de estrategias de mitigación a nivel industrial.

Variabilidad de la carga fúngica entre centros de acopio

Para comparar la distribución de la carga fúngica entre los centros de acopio, se utilizó la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis aplicada a las medianas (Tabla 1). Los resultados evidenciaron diferencias estadísticamente significativas (p-valor = 0,0033), lo que indica que la cantidad de hongos en los granos de cacao está asociada al centro de acopio de procedencia. Esta variabilidad puede explicarse por las diferencias en los procesos de fermentación y almacenamiento implementados en cada centro. En cambio, los factores climáticos fueron descartados como variables influyentes, dado que los cuatro centros se localizan en el mismo cantón y comparten condiciones meteorológicas similares.

La prueba de Kruskal-Wallis fue complementada con la prueba post-hoc de Dunn, aplicando la corrección de Bonferroni para identificar las diferencias espe-cíficas entre los centros de acopio (Figura 4). Los resultados mostraron que la Asociación Piedra de Plata (C_UNO_PP) difirió significativamente de Fortaleza del Valle (C_DOS_FV) y de KAACAO (C_TRES_ KC), con valores de p-ajustada de 0,042 y 0,017, respectivamente. En contraste, no se encontraron diferencias estadísticamente significa-tivas en la cantidad de hongos al comparar los demás centros. Estos resultados sugieren que la Asociación Piedra de Plata (C_UNO_PP) presenta un comportamiento atípico respecto a la carga fúngica, mientras que Fortaleza del Valle (C_DOS_FV), KAACAO (C_TRES_KC) y Aroma de Montaña (C_CUATRO_ AM) muestran niveles compatibles.

Estudios previos, como el de Mendoza Salazar & Lizarazo-Medina (2021), han demostrado que la diversidad microbiana en la fermentación del cacao varía significativamente entre regiones influenciada tanto por la microbiota autóctona como por las condiciones ambientales. De manera similar, los resultados del presente estudio indican que el perfil fúngico de los granos de cacao en el cantón Bolívar está fuertemente influenciado por las condiciones específicas de cada centro de acopio.

En consecuencia, la carga y la composición de los hongos no son aleatorias, sino que están directamente asociadas a las prácticas de procesamiento y al microambiente específico de cada ubicación.

La evidencia sobre el cacao ecuatoriano apoya esta conclusión. Falconí et al. (2023) demostraron que la aplicación de un cóctel microbiano nativo como cultivo iniciador altera de manera significativa la composición de azúcares y ácidos orgánicos, además de modificar parámetros críticos como la temperatura y el pH durante la fermentación. Este control sobre la dinámica microbiana conduce a la reducción de hongos filamentosos, demostrando el impacto directo que tiene la gestión del proceso en la calidad microbiológica del grano.

Asociación entre géneros de hongos y centros de acopio

La prueba exacta de Fisher aplicada sobre la tabla de contingencia que cruza los centros de acopio y la presencia de hongos indicó un p-valor = 0,0003234 (Tabla 2)., evidenciando una asocia-ción significativa (p < 0,05). Este resultado indica que la distribución de la presencia de hongos no es independiente del centro de acopio, lo que refleja diferencias relevantes entre ellos.

Tabla 2

Resultados de la prueba exacta de Fisher para la asociación entre la presencia de hongos y los centros de acopio

Table 2

Results of Fisher's exact test for the association between the presence of fungi and collection centers

Prueba	Variables analizadas	p-value
Fisher's Exact Test	Centros de acopio/Presencia de hongos	0,0003234

Se aplicó la prueba de Fisher para evaluar la asociación entre los géneros fúngicos (Aspergillus spp. y Penicillium spp.) y los centros de acopio. El análisis de la tabla de contingencia reveló una asociación estadísticamente significativa (p = 0,00052; Tabla 3), lo que evidencia que la distribución de estos géneros no es aleatoria si no que está fuertemente influenciada por el centro de acopio de donde provienen los granos de cacao. Este resultado sugiere que factores selectivos de cada centro, como las prácticas de fermentación o las condiciones de almacenamiento, influyen directamente en el establecimiento de la carga fúngica. La presencia predominante de Aspergillus spp. en todos los centros, frente a la detección de Penicillium spp. únicamente en Aroma de Montaña y en la Asociación Piedra de Plata, refuerza la idea de que cada centro de acopio presenta un perfil microbiológico particular determinado por sus métodos de procesamiento.

Tabla 3

Resultados de la prueba exacta de Fisher para la asociación entre los géneros fúngicos (Aspergillus spp. y Penicillium spp.) y los centros de acopio

Table 3

Results of Fisher's exact test for the association between fungal genera (Aspergillus spp. and Penicillium spp.) and collection centers

Prueba	Variables analizadas	p-value
Fisher's Exact Test	Género de hongos / Centro de acopio	0,0005188

Estos resultados se alinean con estudios internacionales, como la investigación en Costa de Marfil por Konan et al. (2024), donde se evidenció una correlación directa entre las condiciones de fermentación y la presencia de microorganismos. Los autores reportaron que los granos fermentados en vainas presentaron un pH superior a 5,5, mientras que aquellos almace-nados en bolsas de polipropileno mostraron una humedad mayor al 8%. Estas variaciones condicionaron la microbiota, con una mayor frecuencia de bacterias del género Bacillus en los granos fermentados en vainas. Asimismo, se observó el predominio de mohos como Aspergillus ochraceus y Aspergillus niger en los granos almacenados en sacos de yute y en vainas, lo que confirma que las prácticas postcosecha constituyen un factor determinante en el perfil fúngico del cacao.

La identificación de las cepas fúngicas presentes en los granos de cacao fermentados de los centros de acopio del cantón Bolívar, mediante el uso de marcadores morfológicos, permitió determinar que la distribución y abundancia de géneros como Aspergillus spp. y Penicillium spp. están directamente influenciadas por las prácticas de procesamiento en cada centro. Este resultado no solo favorece al conocimiento científico de la microbiota fúngica asociada al cacao, sino que también destaca la necesidad de optimizar los procesos de fermentación y almacenamiento para garantizar la calidad e inocuidad del cacao fermentado, principal materia prima en la elaboración de chocolate.

4. Conclusiones

La fermentación de cacao en los centros de acopio del cantón Bolívar está marcada por una elevada diversidad fúngica, en la que predominan los géneros Aspergillus spp. y Penicillium spp., cuya distribución y abundancia mostraron variaciones significativas en los centros analizados. Las diferencias observadas en la morfología, abundancia y asociación de las cepas fúngicas confirman que los procesos de fermentación y almacenamiento ejercen un papel determinante en la configuración del perfil microbiológico del grano. En particular, la predominancia de Aspergillus spp. en todos los centros y la presencia de Penicillium spp. en algunos de ellos, resalta la influencia de las prácticas postcosecha sobre la calidad microbiológica del cacao.

Estos resultados, además de coincidir con investigaciones previas a nivel nacional e internacional, advierten sobre el riesgo que presenta la proliferación de cepas con potencial, lo que implica la necesidad de establecer puntos críticos de control a lo largo de la cadena productiva. En este sentido, la implementación de estrategias de manejo optimizadas, como el uso de cultivos iniciadores y el control biológico, junto con el fortalecimiento de las condiciones de fermentación y almacenamiento, se proyecta como una alternativa clave para garantizar un cacao de alta calidad e inocuidad, consolidando así su valor en la industria chocolatera.

Agradecimientos

Agradecemos a Dios por brindarnos la sabiduría, fortaleza y salud para llevar a cabo este trabajo. Expresamos nuestro sincero agradecimiento a la Mgtr. Diana Cedeño por su valiosa guía y acompañamiento como tutora durante el desarrollo de este proyecto. De igual manera, al Ing. Andrés Santana, por su apoyo técnico y constante disposición a lo largo del proceso en el laboratorio.

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Prueba	Variable dependiente	Variable independiente	Chi-cuadrado (χ²)	GL	p-valor
Kruskal-Wallis	Cantidad de hongos	Centros de acopio	13,742	3	0,0033