1. Introducción
La producción de cultivos de importancia económica, para el mercado local, nacional y externo, requiere contar con genotipos adaptados a cada lugar o región para que puedan soportar las condiciones a las que están sometidos durante los diferentes estados de desarrollo fenológico; esto hace que las investigaciones estén orientadas a lograr suplir estos niveles de exigencias, para una producción exitosa. La biotecnología, a través del cultivo in vitro de tejidos, tiene la ventaja de “multiplicar rápidamente una variedad de la cual sólo existen pocos individuos” (Aguirre et al., 2016); ésta, constituye una herramienta para obtener plantas uniformes a partir de un tejido, explante (Mroginski & Roca, 1993); y una alternativa para una propagación rápida, segura y obtener plantas sanas, libres de patógenos.
La propagación vegetativa de la fresa Fragaria x ananassa Duch. (Rosaceae) se realiza por medio de estolones o por hijuelos de tallos cortos que conforman la corona, con yemas que producen nuevas coronas (Olivera, 2012). El cultivo in vitro ha sido aplicado para la propagación masiva de plantas de fresa desde los años 80 del siglo pasado y se ha ido mejorando y automatizando con el paso del tiempo en diferentes países donde se han implementado programas propios de producción de plantas de fresa libres de patógenos. En la micropropagación se emplea básicamente Bencil Amino Purina (BAP), una citoquinina activa a concentración de 1,0 mgL-1 para inducir la formación de brotes axilares y sin reguladores de crecimiento para inducir el enraizamiento (Boxus, 1999). El medio de cultivo más utilizado para la micropropagación de fresa es el MS (Murashige & Skoog, 1962), que se menciona en la gran mayoría de ensayos de micropropagación de fresa (Martinelli, 1992).
El éxito del cultivo in vitro, radica en obtener un método de desinfección, que evite la contaminación y la fenolización; el uso de bicloruro de mercurio es un buen agente desinfectante, rápido y sencillo para obtener explantes viables en mayor del 80% comparado al hipoclorito de sodio, pero tiene la desventaja de ser muy tóxico (Bedoya et al., 2016). La inducción de la morfogénesis indirecta, en dos medios con la presencia de auxina AIB favoreció la formación de raíces e indujo al desarrollo de pequeñas raíces secundarias (Gómez-Serrano et al., 2010); por otro lado, KIN en la concentración de 2,0 a 2,5 mgL-1, favoreció mejores brotes en la fase de establecimiento de Stevia rebaudiana (Calderon-Acuña & Montes-Godoy, 2017).
En la medida que se incrementó el contenido de cloro en el rango de 10% a 30% de producto comercial y el tiempo de inmersión de 10 a 30 min, la contaminación ha descendido (Sanchez-Cuevas & Salaverría, 2004). El desarrollo de las vitroplantas, dependen del tipo de explante, si es yema de estolón o de corona, en los primeros se encontraron una respuesta a los 13 días comparado a 28 en yemas de corona y las características propias del explante; además, la concentración y tiempo de exposición al desinfectante; al respecto, se reportaron supervi-vencia de 80% a 40% con una exposición de 25 y 30 min en la solución desinfectante (Mamani-Sánchez & Murillo-García, 2020).
La micropropagación de yemas apicales de variedades de fresa en medio de cultivo MS (1962) con 1,25 mgL-1 de BA + 1,0 mgL-1 AIA y MS modificado con KIN 1,0 mgL-1 se encontró que el mayor porcentaje de sobrevivencia fue en el primero en 3 variedades, teniendo solamente un 20% de sobrevivencia para ‘Camino real’ en la tercera siembra (Jiménez & Alvarado, 2014). En el medio MS + vitaminas modificadas + 4,44 µM de BAP y 1,44 µM de GA3, se obtuvo 70% de explantes establecidos con éxito comparado a otros tratamientos (Ruíz-Anchondo et al., 2018). En la respuesta de micropropagación al medio MS con BAP (0,5-2,5 mgL-1), fue 2,0 mgL-1 como concentración óptima, valores mayor o menor a éste, mostraron brotes más bajos en proliferación (Naing et al., 2019).
El medio MS + BAP solo o combinado con IAA fue esencial para la proliferación y multiplicación de brotes de fresa; se encontró que 3,0 mgL-1 de BAP+0,5 mgL-1 de IAA resultó ser mejor con 16,1 ± 0,29 días en la inducción de brotes y 12,8 ± 0,52 como número máximo de brotes (Rokosa & Mikiciuk, 2017). Explantes de fresa, han sido cultivados en MS con 0,5–2,5 mgL-1 de BAP, KIN (1,0-2,0 mgL-1) y GA3 (0,1-1,0 mgL-1), donde, se encontró que después de 4 -5 semanas se desarrollaron brotes en 82% de explantes en un número máximo de 7, en la que 2,0 mgL-1 de BAP superó a KIN y AG3 (Badal et al., 2019). En el cultivar 'Winter Dawn' y 'Sweet Charlie' incubados en MS al 75% + 0,5 mgL-1 AB + 0,1 mgL-1 KN, se encontró una diferencia del 15% en la tasa de multiplicación (Dhukate et al., 2021). La multiplicación en el cultivar ‘RubyGem’, en medio MS suplementado con 1,0 mgL-1 BAP y 0,1 mgL-1 IBA con la adición de nitrato de plata, AgNO3, 10 mgL-1, fue superior en comparación al testigo, libre de AgNO3 (Nasir & Abdulhussein, 2022). En fresa, cultivar ‘Pharachatan 80’ en medio MS con reducción de nitrato de potasio suplementado con BAP, 1,0 mgL-1, favoreció la longitud de brote (Poothong, 2020).
En regeneración y multiplicación de variedades de fresa, han determinado que la concentración de BAP, 1,0 mgL-1 se obtuvo menores resultados seguido de 1,5 mgL-1, con promedios de 11,28 y 10,48 raíces por explante (Mohamed et al., 2018); mientras que, en otro trabajo encontraron 5,0 cm de longitud de raíz en MS con 1,0 mgL-1 de BAP (Monirul-Islam, 2018); en el cv. ‘Hadar’, en el medio MS suplementado con IBA (1,5 mgL-1) y NAA (1,5 mgL-1), a los 6 días de incubación se obtuvo 80% de enraizamiento (Tung et al., 2021).
Existe una gran variación en la respuesta de los genotipos al medio y condiciones micro ambientales, que puede deberse a las especies e intra especie, es frecuente encontrar que a similares condiciones los cultivares respondan de diferente manera (Krikorian, 1993); a pesar de que existe mucha información sobre los medios de cultivo y variedades de este cultivo; aún existe dificultades para la micropropagación a nivel comercial (Valliath & Mondal, 2023). Frente a esto, es necesario que una vez establecido un medio que funcione para un cultivar, sea también probado su comportamiento frente a otras variedades, por ello indujo a realizar la presente investigación de micropropagación a partir de yemas de corona de fresa en las variedades ‘Aromas’, ‘Albión’ y ‘Camarosa’. El objetivo fue determinar la respuesta de las variedades ‘Aromas’, ‘Albión’ y ‘Camarosa’ de fresa Fragaria x ananassa Duch. en la micropropagación a partir de yemas de corona en medio MS con reguladores de crecimiento.
2. Material y métodos
La investigación de micropropagación en fresa Fragaria x ananassa Duch fue realizada en el laboratorio de Biotecnología Vegetal de la Universidad Nacional Daniel Alcides Carrión, Filial Oxapampa. El diseño utilizado fue Bloques completos al azar (Gutiérrez & de la Vara, 2008); los tratamientos, fueron las variedades de fresa: ‘Aromas’ (t1), ‘Albión’ (t2) y ‘Camarosa’ (t3) (Figura 1) y 04 repeticiones. La unidad experimental estuvo conformada por ocho explantes, yemas de corona, en la fase de establecimiento; y, nueve en la de multiplicación y enraizamiento in vitro.
La Población, fue la especie Fragaria x ananassa Duch, variedades ‘Aromas’, ‘Albión’ y ‘Camarosa’ obtenidas el año 2018 de la Estación Experimental Agraria, INIA Donoso, Huaral, Lima, Perú, desarrolladas bajo las condiciones de invernadero del proyecto, en el distrito de Oxapampa. La muestra estuvo conformada por yemas de corona de las variedades mencionadas, los medios de cultivo en ocho tubos de ensayo de 16x150 mm por unidad experimental en la fase de establecimiento y nueve en las fases de multiplicación y enraizamiento.
En la fase de establecimiento, los explantes fueron obtenidos de plantas manejadas en el invernadero y llevados al Laboratorio de Biotecnología Vegetal, donde fueron lavados con agua de caño por 30 min; posteriormente, se defoliaron, retiraron las raíces y se colocaron en un vaso de precipitados de 1000 mL con jabón líquido 15,0 mgL-1 durante 5 min y seis enjuagues con agua destilada estéril. En la cámara de flujo laminar, se sumergieron en etanol 70% durante 1 min y sumergidas en NaOCl al 2% más 2 gotas de Tween 20 por cada 100 mL (Figura 2), durante 25 min; se realizaron tres lavados con agua destilada estéril y sumergidas en solución antioxidante de Ácido ascórbico 300 mgL-1 + Ácido cítrico 100 mgL-1 durante 10 min.
Figura 1. Plantas madre de fresa Var. ‘Aromas’ (a); ‘Albión’ (b) y ‘Camarosa’ (c).
Figura 2. Explantes de las tres variedades de fresa en proceso de desinfección.
Las yemas de corona se extrajeron cuidadosamente de los explantes, con el uso de pinzas y bisturí Nº 11 bajo un estereoscopio ACCU-SCOPE y sembrados en tubos de ensayo de 16x150 mm, conteniendo 9 mL de medio de establecimiento, con sales y vitaminas MS (Ugale & Barwant, 2020) más BAP 0,5 mgL-1, AIA 0,6 mgL-1, 30 mgL-1 de sucrosa, 9 mgL-1 de agar y pH igual a 5,6, esterilizado previamente en autoclave a 121 °C y 0,1 MPa por 20 min e incubados a 23°C, 60% de humedad relativa, fotoperiodo de 16 horas luz, por 32 días, y con luminosidad de 14,02 µmol.m-2.s-1.
Las variables evaluadas en establecimiento in vitro, fueron presencia de micelios (hongos), colonias de bacterias, fenolización (número de explantes con más del 50% de tejido de color marrón oscuro), sobrevivencia (N° de explantes que mantuvieron el tejido de color verde natural), explantes brotados (N° de explantes por tratamiento con formación de brotes), brotes por explante y longitud de brote (mm). Las lecturas fueron realizadas a los 8 y 18 días después de la inoculación (ddi) en el caso de las variables hongos, bacterias y fenolización. A los 24 y 32 ddi se realizaron las lecturas de las variables explantes brotados (brotamiento), número y longitud de brotes, mientras que la variable sobrevivencia se evaluó a los 8 ,18, 24 y 32 ddi.
En la fase de multiplicación, los pequeños brotes, producto del establecimiento in vitro de las yemas de corona, fueron transferidas a tubos de ensayo de 25x150 mm con 12 mL de medio de multiplicación previamente esterilizado, elaborado con sales y vitaminas, MS+BAP 0,5 mgL-1, 30 mgL-1 de sucrosa, 9 mgL-1 de agar y pH igual a 5,6; las yemas fueron incubadas a las mismas condiciones de establecimiento excepto en luminosidad (16,39 µmol.m-2.s-1), durante 32 días para la proliferación de nuevos brotes. Las variables evaluadas fueron, N° de brotes explante-1, longitud de brote (mm) y N° de hojas por explante. Las lecturas fueron realizadas a los 11, 18, 24 y 32 ddi.
En la fase de enraizamiento, los brotes obtenidos de la multiplicación, fueron individualizados en tubos de ensayo de 25x150 mm con 12 mL de medio, elaborado con sales y vitaminas MS, 30 mgL-1 de sucrosa, 9 mgL-1 de agar y pH igual a 5,6 e incubados a las mismas condiciones de establecimiento y multiplicación excepto en luminosidad (18,69 µmol.m-2.s-1) durante 32 ddi; las vitroplántulas completamente enraizadas fueron trasladadas al invernadero para su aclimatación ex vitro. Las variables evaluadas fueron N° de raíces por vitroplanta y longitud de raíz (mm) considerada la raíz más larga. Las lecturas fueron realizadas a los 11, 18, 24 y 32 ddi.
El procesamiento de datos fue realizado en el software estadístico R v. 4.2.3; para las variables dicotómicas se utilizó la prueba Q de Cochran y comparación múltiple de Dunn, α=0,05; el Anova para determinar significancia; y la prueba de comparación múltiple de Duncan (α = 0,05) para encontrar el mejor tratamiento. Antes de ser procesados fueron transformados con , para cumplir con los supuestos de normalidad de Shapiro y homogeneidad de varianzas de Levene.
3. Resultados y discusión
La micropropagación in vitro de fresa Fragaria x ananassa Duch. variedades ‘Aromas’ (t1), ‘Albión’ (t2) y ‘Camarosa’ (t3) a partir de yemas de corona, se describe a continuación.
Establecimiento
No hubo contaminación por hongos; con la prueba Q de Cochran (Tabla 1) se determinó diferencias estadísticas en fenolización y sobrevivencia a los 8 y 18 ddi; mientras que, en contaminación por bacterias no hubo diferencias a los 8 ddi; sin embargo, con la prueba de comparación múltiple de Dunn (α = 0,05) se determinó que el t3 fue superior en las tres variables, excepto a los 18 ddi, que en sobrevivencia fue igual a t2; mientras que a los 24 ddi, la prueba Q de Cochran indica que hay diferencias significativas en brotamiento y sobrevivencia, y a los 32 ddi solo hubo diferencias para sobrevivencia; y con la prueba de Dunn, a los 24 ddi, t3 fue superior e igual a t2, pero a los 32 ddi en brotamiento t1 fue igual a t2, ambos superiores a t3 y en sobrevivencia t3 fue superior e igual a t2; esto evidencia que, las variedades mencionadas presentan diferentes respuestas durante los días de incubación para la fase de establecimiento.
El Anova (Tabla 2), a los 24 ddi, mostró diferen-cias estadísticas significativas para brotes por explante y diferencias altamente significativas para longitud de brote; mientras que, a los 32 ddi, mostraron diferencias significativas en longitud de brote, y altamente significativas en número de brotes por explante. La prueba de comparación múltiple Duncan (α = 0,05), determinó que, a los 24 y 32 ddi, en las variables evaluadas, ‘Camarosa’ fue superior a ‘Aromas’ e igual a ‘Albión’; excepto, a los 32 ddi que, en brotes por explante fue superior a las dos variedades; esto demuestra que las tres variedades de fresa (Figura 3), tienen una variación en la respuesta al medio utilizado para esta fase.