Detección de almidón en leche en polvo basado en espectroscopia Raman y mínimos cuadrados parciales

 

Detection of starch in milk powder based in Raman spectroscopy and partial least squares

 

José Antonio Blas-Matienzo

 

 

Facultad de Ingeniería en Industrias Alimentarias, Universidad Nacional Agraria de la Selva. Carretera Central km 1.21, Tingo María, Perú.

 

 *Autor correspondiente: joseblasm056@gmail.com (J.A. Blas-Matienzo)

DOI: http://dx.doi.org/10.17268/agroind.sci.2019.02.04

 

 

RESUMEN

Esta investigación tuvo como objetivo establecer un modelo matemático, haciendo uso de información espectral Raman y el algoritmo regresión de mínimos cuadrados parciales (PLS), para pronosticar el porcentaje de adulteración de la leche en polvo por almidón. El modelo de regresión obtenido puede ser usado para identificar muestras que presenten almidón en la leche en polvo en concentraciones en el rango del 5% al 40% (p/p). Se utilizó el método de la validación cruzada con la estrategia de dejar una muestra fuera. El intervalo que resultó optimo es el rango de numero de onda de 2170-2272 cm-1. El modelo de regresión lineal obtenido presenta coeficiente de correlación múltiple de 99,99%, valor mínimo de suma de cuadrados del error residual pronosticado (PRESS) de 237,4 y el valor del estadístico F (19210,29) nos permite establecer que si existe una relación lineal significativa entre las intensidades Raman y los valores de las concentraciones de almidón en la mezcla. El valor del nivel crítico p= 0,006 indica que, si existe una relación lineal significativa, y, por tanto, que el hiperplano definido por la ecuación de regresión ofrece un buen ajuste.

Palabras clave: mínimos cuadrados parciales; leche en polvo; almidón; espectroscopia Raman; intervalo PLS.

 

ABSTRACT

This research aimed to establish a mathematical model, using Raman spectral information and the partial least squares regression algorithm (PLS), to predict the percentage of adulteration of powdered milk by starch. The regression model obtained can be used to identify samples that show starch in powdered milk in concentrations ranging from 5% to 40% (w/w). The cross-validation method was used with the strategy of leaving a sample out. The interval that was optimal is the wave number range of 2170-2272 cm-1. The linear regression model obtained has a multiple correlation coefficient of 99.99%, minimum sum of squares of the predicted residual error (PRESS) of 237.4 and the value of the F statistic, 19210.29 allows us to establish that if there is a relationship Linear significance between Raman intensities and the values ​​of starch concentrations in the mixture. The value of the critical level p = 0.006 indicates that there is a significant linear relationship, and therefore, that the hyperplane defined by the regression equation offers a good fit.

Keywords: partial least squares; milk powder; starch; Raman spectroscopy; interval PLS.

1. Introducción

El tema de la autenticidad de los alimentos es actual y de gran importancia para investigadores, consumidores, productores e industriales en toda la cadena producción-consumo de leche y sus derivados. Todo producto terminado, e incluso la materia prima, debe cumplir con los requerimientos legales enunciados en su etiquetado, considerando ingredientes, proceso de producción e identidad genética (Escobar,2014).

Un aditivo no permitido que ha sido agregado a la leche en polvo es el almidón, un polisacárido formado por residuos de α-D-glucosa, compuesto de dos macromoléculas, amilosa y amilopectina. El almidón es agregado para ajustar la densidad y punto de congelación de la leche adulterada.  Este producto es ampliamente usado en la industria alimentaria, debido a su bajo valor comercial y fácil acceso (De Almeyda et al.,2012).

Generalmente, la identificación es hecha por gel permeacion con cromatografía liquida de alta performance (GP-HPLC) (Olieman y Van Den Bedem, 1983)). La presencia de almidón en leche es hecha cualitativamente por una reacción colorimétrica entre leche y solución de lugol, donde el desarrollo de color azul indica la presencia de almidón en la leche (De Almeyda et al.,2012).

La espectroscopia infrarroja cercana ha sido extensamente aplicada en el estudio de la leche y sus constituyentes. Iñon et al. (2004) evaluaron los componentes principales (carbohidratos, lípidos y proteínas) de diferentes tipos de leche en polvo por espectroscopia infrarroja con Transformada de Fourier (FTIR) con un accesorio de atenuación de la reflexión total (ATR) y calibración multivariada para análisis cuantitativo.   Borin et al. (2006) propusieron un método para cuantificar el suero, almidón y sacarosa en leche en polvo usando espectroscopia infrarroja cercana (NIR), calibración multivariada y técnicas de inteligencia artificial, a partir de imágenes hiperespectrales.

Sin embargo, a pesar de las numerosas aplicaciones de la espectroscopia Raman, hay pocos estudios de su uso para la calidad de la leche en polvo.  Moros et al. (2007), evaluaron los parámetros nutricionales de las fórmulas para infantes usando espectroscopia Raman y regresión de mínimos cuadrados parciales (PLS).  McGoverin et al. (2010) propusieron el uso de la espectroscopia Raman y calibración multivariada (PLS) para la determinación de lípidos y proteínas en la leche en polvo, los resultados obtenidos fueron satisfactorios cuando se compararon con los resultados de la espectroscopia infrarroja.

La espectroscopia Infrarroja y Raman nos provee de información química detallada y se usa rutinariamente en diferentes áreas como la farmacéutica, la de polímeros, forense, ambiental, ciencia de los alimentos, etc.  (Rafferty, 2002). A menudo la identificación y cuantificación de componentes en muestras biológicas por métodos espectroscópicos solo se ven obstaculizados por la naturaleza diversa de la muestra. Para obtener información significativa y para una visión más profunda necesitamos procesar y analizar los datos.

Los métodos analíticos que tratan con una sola variable a la vez se denominan métodos univariados. Sin embargo, ninguna de las mediciones espectroscópicas depende de una sola variable. Los datos espectroscópicos consisten de cientos de variables (número de onda) y mediciones de intensidad Raman en unidades arbitrarias. Para utilizar la información que nos brinda los espectros y manipular el gran conjunto de datos se necesita el análisis multivariado. El análisis de datos multivariado se refiere a los métodos de análisis de datos que tratan con más de una variable a la vez. El principal objetivo de estas técnicas estadísticas de análisis de datos es encontrar la relación existente entre las variables.  Esto se basa en la idea de considerar muchas variables no selectivas en lugar de una sola variable y luego finalmente combinarlas en un modelo multivariado. La aplicación de los métodos estadísticos multivariados a la química y a la biología se denominan quimiometria (Deming, 1986). Las herramientas del análisis multivariado se utilizan para efectuar un procesamiento eficiente de la gran cantidad de datos y alinear sus detalles informativos (Svante, 1991). Usando las herramientas analíticas multivariadas, los patrones existentes en los datos, pueden ser modelados y estos modelos pueden ser usados para predecir la adquisición de nuevos datos de un tipo similar.  Varios métodos de extracción de datos, tales como, el análisis de componentes principales (PCA), análisis discriminante linear (LDA), regresión lineal múltiple (MLR), análisis de cluster (CA) y regresión de mínimos cuadrados parciales (PLSR), para nombrar unos pocos son empleados en el campo de la espectroscopia Raman e Infrarroja (Ritz et al.2011).En la presente investigación, haciendo uso de la espectroscopia Raman y la quimiometria, se llegó a establecer una ecuación de regresión que nos permitió pronosticar el porcentaje de adulteración de la leche en polvo por almidón.

 

2.Material y métodos

2.1. Sistema de espectroscopia Raman

El sistema de espectroscopia Raman fue de la marca Horiba, modelo Xplora Plus Raman Microscope.

2.2. Preparación de la muestra

Para los análisis cuantitativos se prepararon 8 muestras diferentes de la mezcla de leche en polvo con almidón en las concentraciones de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% y 40% (p/p) de almidón. Para la obtención de los espectros de las muestras estas fueron colocadas en una placa de vidrio.  El uso de la placa de vidrio simplifica el experimento y el procesamiento de datos ya que no interfiere con la señal espectral de la muestra.

2.3. Adquisición espectral

Para desarrollar el método de análisis de cada muestra se obtuvo tres espectros, y los espectros obtenidos fueron agrupados para poder realizar el pretratamiento, que consiste en la obtención del promedio de espectros, el suavizado espectral mediante la aplicación del filtro de Savitzky-Golay y el establecimiento de una línea de base, posteriormente, se realizó la normalización, el cual es un paso previo al desarrollo de un modelo de calibración.

2.4. Análisis espectral y procesamiento de datos

La Figura 1 representa la señal Raman de la leche en polvo sin adulterar. Después de obtener los datos de las intensidades de las señales espectrales Raman, en unidades arbitrarias, para las diferentes mezclas de leche en polvo-almidón en sus diferentes porcentajes, se escogió como rango total, el comprendido en el rango de número de onda de 212-3497 cm-1. Seguidamente se dividió este espectro total en 30 intervalos, conteniendo cada uno de ellos, 30 variables, haciendo un total de 900 variables. Teniendo en cuenta que en la investigación presente no se puede utilizar el centrado-promedio o autoescalado (Häggblom, 2018),   por corresponder esta investigación al tipo de control de calidad, los datos de la intensidad Raman de cada intervalo fueron normalizados, sumando los valores de intensidad Raman de las 30 variables y luego dividiendo el valor de cada variable entre este total, procediendo de este modo para cada porcentaje de la mezcla, y luego sometidos al algoritmo de regresión de mínimos cuadrados parciales, NIPALS (Nonlinear Iterative Partial Least Squares), del programa Minitab 17, procediendo de esta manera para cada intervalo.

 

3. Resultados y discusión

En la Figura 2 se presentan los espectros Raman obtenidos para las 8 mezclas de leche en polvo-almidón. Todos los modelos son desarrollados sobre la base de los espectros Raman (X) y la variable porcentaje de almidón en la mezcla (y).

Todos los modelos desarrollados son validados por validación cruzada utilizando la estrategia de dejar fuera una muestra, cada vez, para la validación. Esto significa que dado los 8 espectros para calibración y ejecutar el algoritmo de regresión de mínimos cuadrados parciales (PLS), este ejecuta la calibración usando 7 espectros y usa esta calibración para predecir la concentración de la muestra dejada fuera. Este proceso se repite, en este caso, 8 veces hasta que cada espectro haya sido dejado fuera. Los resultados de la aplicación del algoritmo a cada uno de los 30 intervalos se tienen en las tablas 1 y 2.

En la Tabla 1 se resumen los estadísticos del análisis de varianza de los modelos de cada uno de los intervalos y en la Tabla 2 se indican los estadísticos de bondad de ajuste (varianza, error, R2, PRESS, R2 pred) respectivamente. En la Tabla 2 se comparan los resultados obtenidos para cada uno de las ecuaciones o modelos obtenidos al aplicar PLS a cada uno de los 30 intervalos. Según Haalang y Thomas (1988) y Ni et al. (2008) los parámetros, suma de cuadrados del error residual de la predicción (PRESS) y el número de componentes seleccionados se emplean para elegir las regiones espectrales importantes y para eliminar las otras regiones.

El mejor modelo de regresión, basado en los intervalos, debe requerir el menor número de componentes PLS y producir los valores más bajos de PRESS. El Coeficiente de correlación (R2), Coeficiente de correlación de predicción (R2pred) y el valor de la prueba de Fischer, F, y por consiguiente el valor de p, son otros parámetros que ayudan en la selección del mejor intervalo. Teniendo esto en cuenta, el mejor intervalo resultó ser el intervalo número 17, que comprende el rango de numero de onda de 2170 - 2272 cm-1.

3.1. Resultados PLSR intervalo

En esta sección se enfoca la situación donde se aplica el algoritmo PLSR a cada uno de los 30 intervalos en los que se dividió el rango total de numero de onda 212-3497 cm-1. Cada intervalo consta de 30 variables.

Los valores de intensidad Raman son normalizados según lo indicado anteriormente para cada muestra a fin de poder aplicar el algoritmo

 

Figura 1. Espectro Raman de leche en polvo sin almidón.

 

 

Figura 2. Espectros Raman de las 8 mezclas de almidón con leche en polvo.

Observando los valores resultantes de los parámetros PRESS, R2 y R2Pred podemos determinar que el intervalo 17 es el óptimo porque presenta el valor más bajo posible para el parámetro PRESS, los valores más altos tanto para R2 como para R2 pred, no existiendo una diferencia abismal entre estos valores, indica que no hay sobreajuste del modelo y los 6 componentes seleccionados explican 98,98% de la variabilidad en los predictores y la respuesta. En la Tabla 3, se presenta el resumen del análisis de varianza para el intervalo óptimo y en la Tabla 4, un resumen detallado consecuencia de aplicar PLS al intervalo óptimo.

Tabla 1

Resumen de análisis de varianza

N° intervalo

Intervalo, cm-1

F

P

1

212-347

5,68

0,055

2

351-483

17,28

0,006

3

488-618

11,74

0,019

4

622-750

4,17

0,087

5

754-879

5,81

0,053

6

883-1006

5,83

0,049

7

1011-1132

7,60

0,030

8

1136-1255

1,55

0,260

9

1259-1375

2,93

0,138

10

1379-1494

5,63

0,055

11

1498-1611

13,69

0,014

12

1615-1726

38,54

0,025

13

1730-1839

10,31

0,018

14

1842-1950

0,80

0,404

15

1953-2059

4,02

0,092

16

2063-2166

36,71

0,001

17

2170-2272

19210,29

0,006

18

2275-2376

0,70

0,436

19

2379-2478

9,68

0,021

20

2481-2578

16,90

0,184

21

2582-2677

146,16

0,001

22

2681-2775

24,55

0,003

23

2778-2870

3,15

0,131

24

2874-2965

52,69

0,019

25

2968-3057

3,13

0,150

26

3057-3146

3,10

0,190

27

3149-3236

9,14

0,021

28

3239-3324

7,63

0,030

29

3327-3411

50,18

0,000

30

3414-3497

5,71

0,054

 

Tabla 2

Estadísticos de bondad de ajuste de los modelos de cada intervalo

N°  intervalo

c.s.

Varianza

Error

R2

PRESS

R2(pred.)

1

1

0,65799

539,600

0,4860

948,1

0,0970

2

1

0,90620

270,650

0,.7422

415,8

0,6040

3

3

0,97805

107,070

0,8980

540,2

0,4855

4

1

0,57660

619,720

0,4097

1782,0

0,0000

5

1

0,50821

533,610

0,4918

1383,8

0,0000

6

2

0,85460

315,179

0,6998

803,6

0,2346

7

2

0,67670

259,837

0,7500

1225,0

0,0000

8

1

0,54060

834,802

0,2049

17431,4

0,0000

9

1

0,85795

705,196

0,3284

1369,6

0,0000

10

1

0,51407

541,720

0,4841

5451,3

0,0000

11

3

0,83749

93,000

0,9112

1331,0

0,0000

12

5

0,95673

10,000

0,9873

1061,3

0,0000

13

1

0,12520

386,000

0,6321

4993,1

0,0000

14

1

0,31709

925,000

0,1182

4476,1

0,0000

15

1

0,41391

629,030

0,4009

2407,2

0,0000

16

2

0,52326

66,952

0,9362

625,0

0,4048

17

6

0,98989

0,009

0,9999

237,4

0,7739

18

1

0,62296

940,893

0,1039

1692,4

0,0000

19

1

0,62011

401,790

0,6173

718,7

0,3155

20

6

0,97977

10,252

0,9902

1040,8

0,0087

21

4

0,80813

5,360

0,9949

698,9

0,3344

22

2

0,77589

97,025

0,9076

2804,5

0,0000

23

2

0,99321

464,995

0,5571

5290,0

0,0000

24

5

0,99873

7,910

0,9925

1288,7

0,0000

25

3

0,93895

314,008

0,7009

6537,8

0,0000

26

4

0,98204

204,424

0,8053

4432,5

0,0000

27

2

0,85865

225,588

0,7852

960,0

0,0857

28

2

0,83371

259,145

0,7532

2083,1

0,0000

29

2

0,69077

49,827

0,9525

929,9

0,1144

30

1

0,65371

538,035

0,4876

902,5

0,1405

c.s.: componentes seleccionados.

Este intervalo presenta el valor más alto de la prueba estadística de Fischer, F, y por consiguiente el valor más bajo de p, 0,006, lo que está de acuerdo con lo que establece Norgaard et al. (2000) y Marbach y Heise (1990).

 

Tabla 3

Resumen del ANOVA para el intervalo óptimo

Fuente

G.L.

S.C.

MS

F

P

Regresión

6

1049,99

174,998

19210,29

0,006

Error Residual

1

0,01

0,009

Total

7

1050,00

 

 

 

 

Tabla 4

Resumen del modelo al aplicar PLS al intervalo óptimo

C

Varianza X

Error

R2

PRESS

R2 pred

1

0,403342

224,727

0,78597

820,064

0,218986

2

0,667897

48,874

0,95345

354,184

0,662682

3

0,808488

4,711

0,99551

317,330

0,697781

4

0,879915

0,720

0,99931

242,474

0,769072

5

0,963282

0,089

0,99992

242,526

0,769023

6

0,989894

0,009

0,99999

237,377

0,773927

C.: componentes.

 

Y en la Tabla 5 se presentan los coeficientes del modelo matemático logrado en el intervalo óptimo.

 

Tabla 5

Coeficientes del modelo

Número de onda, cm-1

Coef.

Número de onda, cm-1

Coef.

Número de onda, cm-1

Coef.

40,384

2170,22

50,287

2205,59

-28,033

2240,76

-2,269

2173,76

90,603

2209,11

-18,960

2244,27

-20,857

2177,31

122,989

2212,64

-45,062

2247,78

-27,336

2180,85

99,308

2216,16

-54,877

2251,28

-37,500

2184,34

245,058

2219,68

9,617

2254,78

-109,278

2187,93

111,146

2223,2

-63,747

2258,28

-50,486

2191,46

135,415

2226,72

-48,789

2261,78

-38,384

2195,00

70,330

2230,30

-204,281

2265,27

-49,234

2198,53

34,240

2233,74

-484,574

2268,77

34,013

2202,06

-22,730

2237,25

48,925

2272,26

31,812

 

Examinando la Figura 3 observamos que los puntos siguen una trayectoria lineal indicando que el modelo si se ajusta y predice bien los datos.

Los resultados de esta investigación podrían servir para la fabricación de instrumentos de análisis para la determinación de la adulteración de leche en polvo por almidón cuyos componentes nos proporcionen la radiación Raman solamente en el rango de 2170 - 2271 cm-1, disminuyendo los costos de los instrumentos.

 

 

Figura 3. Concentraciones pronosticadas contra concentraciones conocidas.

 

4. Conclusiones

 

Se reporta un nuevo método analítico para la determinación cuantitativa de almidón como adulterante en leche en polvo, basado en la utilización de los datos espectrales Raman (X) y la concentración de almidón en la mezcla (y) y la aplicación de la regresión de mínimos cuadrados parciales (PLSR) a cada uno de los 30 intervalos (iPLS) en los que se dividió el espectro total. Resultó como intervalo óptimo el que comprende el rango de numero de onda 2120 - 2272 cm-1. La relación entre la intensidad Raman y porcentaje de almidón presenta un coeficiente de correlación de 99,99%. Ante una muestra desconocida de mezcla almidón-leche en polvo, tendrá que encontrarse primero su espectro y los valores de la intensidad Raman en los números de onda y luego serán normalizados y reemplazados en el modelo para determinar el valor de Y. Trabajos futuros podrían usar esta información para desarrollar modelos cuantitativos para la determinación del grado de adulteración de múltiples contaminantes en alimentos sólidos.

 

Referencias bibliográficas

 

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